轉谷氨酰胺酶交聯大豆分離蛋白結構表征

臧學麗，陳 光*

（1.長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118）

大豆營養豐富，蛋白質含量較高，是人類攝取最廉價和最優質的植物蛋白來源[1]。大豆蛋白中人體必需氨基酸含量豐富[2]，各成分分布均衡[3]，是人類獲取植物蛋白的主要來源。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是大豆中主要的蛋白成分，主要由7S及11S球蛋白組成，是優質的植物蛋白[4]。SPI具有一定溶解性、凝膠性、乳化性等功能特性，并被廣泛應用于食品等多個領域[5-7]。但天然的SPI功能特性并不理想，未經加工的SPI功能尚不能滿足人們在日常生產中的需求。目前大豆蛋白改性的方法有物理法、化學法、生物酶法。物理法和化學法改性存在凝膠效果不好或食品發全等問題，生物酶法具有發全可靠、反應溫和等優點，已成為研究熱點[8-9]。

轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）是一種能催化蛋白質中賴氨酸上的-氨基與谷氨酸上γ-羥酰胺基之間發生聯合反應的酶[10]，能聚合蛋白多肽之間形成共價聚合物。TGase交聯能改變SPI的溶解性、凝膠特性、疏水性等[11]。Walsh等[12]采用TGase對SPI進行處理，研究表明經TGase處理后，SPI的溶解性顯著提高，溶解特性得到改善。Gan等[13]采用TGase為改性劑交聯SPI，研究結果顯示，經過TGase改性的SPI凝膠強度和黏彈性均有顯著的變化。SPI經過酶作用后，蛋白內部的非極性氨基酸殘基暴露到表面，使蛋白的疏水性增大，發生聚集效應[14]，形成凝膠。但TGase處理大豆蛋白結構和功能變化的關系及作用機制的研究還不系統，限制了酶改性SPI工業的發展。

本實驗通過熱力學、波譜學、微觀結構等方法對TGase交聯SPI的二級結構進一步分析，采用差示掃描量熱儀、紅外光譜、掃描電鏡、X-射線衍射、圓二色譜[15-16]等研究TGase交聯SPI二級結構的變化，進一步探索TGase交聯對SPI分子結構的影響，為TGase交聯SPI的作用機制提供理論基礎，以期為大豆制品的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吉林芽豆SPI由實驗室自制；TGase 美國Sigma公司；氨基酸檢測標準品 日本Wako公司；溴化鉀（分析純） 美國Amresco公司；磷酸鹽緩沖溶液 東莞樹萬化工有限公司；戊二醛（分析純） 廣東翁江化學試劑有限公司；乙醇（分析純） 常州市啟迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

L-8900型氨基酸全自動分析儀 日本日立公司；3K15臺式高速冷凍離心機 美國Sigma公司；ALPHA1-4LSC冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；DSCq2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；Sanyo Versatile圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；AF206制冰機 美國Scotsman制冰機系統有限公司；BC-163D酸度計 北京市華云分析儀器研究所；D8廣角X-射線衍射儀、TENSOR 27紅外光譜儀 德國Bruker公司；MLS-3780超低溫冰箱日本Sanyo Labo Autoclave公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；85-1C磁力攪拌機 上海梅穎浦有限公司；EVO MA 25掃描電鏡 德國卡爾蔡思公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參照Sorgentini等[17]方法并略作改動。吉林芽豆經粉碎脫脂后得到大豆粉為原料，按照豆粉與水的比例1∶10（g/mL）混合，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至8.0。4 ℃低溫攪拌提取2 h，8 000×g離心30 min。上清液用1 mol/L HCl溶液調pH值至4.5，在室溫下靜止1 h，再次離心，條件同上，棄掉上清液。沉淀用去離子水溶解，并用1 mol/L NaOH溶液調pH值至7.0。充分攪拌溶解后，4 ℃低溫條件下對提取液透析24 h除鹽，冷凍干燥制備得SPI，4 ℃保存備用。

1.3.2 TGase交聯SPI樣品的制備

將SPI配制成2%蛋白溶液，按照TGase交聯SPI制得凝膠強度最佳條件[18]，即酶添加量34.67 U/g、反應溫度60 ℃、pH 7.22、反應時間2.21 h，立即放入冰浴中，然后進行冷凍干燥，得到SPI交聯樣品。

1.3.3 表面疏水性的測定

采用1-苯胺基-8-萘磺酸（1-a n i l i n o-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光分光光度計法。準確稱取交聯前后最佳條件下的SPI樣品0.01 g，溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下，攪拌1 h，10 000 r/min離心20 min。上清液用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）稀釋成不同的質量分數，分別為0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%。以上稀釋液樣品分別量取4 mL，加入濃度為8 mmol/L的ANS（配制時，采用同一緩沖溶解）溶液40 μL，充分混勻。在室溫條件下靜止10 min。溶液中不加ANS作為空白，在激發波長為390 nm，發射波長470 nm條件下，用熒光分光光度計測定蛋白樣品的熒光強度。橫坐標為蛋白質的濃度，縱坐標為不同濃度蛋白對應的熒光強度，作圖。蛋白質的表面疏水性指數（S0）用曲線初始階段的斜率表示。

1.3.4 自由氨基含量的測定

取酶交聯前后最佳條件下的SPI 250 μL，加入4.0 mL 0.2 mol/L pH 8.2的磷酸緩沖液混勻，加入0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液2 mL，混合均勻。置于50 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后在反應體系中加入亞硫酸鈉溶液4.0 mL，終止反應。靜止20 min，在室溫下，用紫外分光光度計測定波長420 nm處吸光度。以不加入SPI的樣品作為對照，計算自由氨基含量。

1.3.5 差示掃描量熱分析

準確稱取5.0 mg交聯前后最佳SPI凝膠強度的蛋白凍干粉，放置于鋁干鍋中，用壓片機壓片密封，選擇空白壓片干鍋盒作為對照，升溫速率為5 ℃/min，升溫范圍30～140 ℃。分析差示掃描量熱曲線，得到最佳條件下交聯前后蛋白樣品的變性溫度和變性焓值。

1.3.6 TGase加入后SPI凝膠掃描電鏡分析

取適量的TGase交聯前后最佳條件下SPI的蛋白凍干粉。5 000 r/min離心10 min，保留沉淀并均勻分散于4%的戊二醛溶液中，4 ℃冰箱中過夜固定。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3 次。使用乙醇溶液（體積分數30%、50%、70%、85%、95%）逐級脫水，無水乙醇脫水2 次，每次脫水時間為15 min。5 000 r/min離心10 min回集沉淀物。真空冷凍干燥機中冷凍干燥，電鏡檢測。

1.3.7 X-射線衍射分析

將交聯前后最佳條件下SPI的蛋白凍干粉樣。放入X-射線衍射儀中，對廣角X-射線衍射進行分析。測試條件：波長0.154 nm，電壓40 kV，電流50 nA，衍射角范圍3～50 ℃。

1.3.8 紅外光譜掃描

準確稱取1 mg交聯前后最佳條件下干燥蛋白凍干粉。加入100 mg溴化鉀，充分研磨混勻，進行全波段掃描，波長范圍為4 000～400 cm-1。分辨率4 cm-1，掃描次數為32 次。

1.3.9 圓二色譜分析

稱取交聯前后最佳條件下5 mg SPI樣品，溶于5 mL pH 7.2的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下攪拌25 min，8 000 r/min離心10 min。回集上清液稀釋至0.1 mg/mL進行圓二色譜檢測。圓二光譜的檢測波長為190～250 nm。

1.3.10 氨基酸組分分析

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》的方法測定。利用氨基酸自動分析儀測定TGase交聯前后最佳條件下SPI蛋白凍干粉樣品17 種氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 TGase對SPI表面疏水性的影響

圖1 TGase交聯對表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of TGase cross-linking on the surface hydrophobicity of SPI

如圖1所示，交聯后提高了SPI的表面疏水性，表面疏水性指數由原來的282.10增加到383.32，提高了35.9%。表面疏水性提高，分析原因有可能是表面疏水性由蛋白質的表面殘基暴露的程度所決定。暴露于分子表面疏水性殘基越多，表面疏水性越強，SPI經TGase催化后，使SPI的結構發生了改變，多肽鏈展開，疏水區域從分子內部基團逐漸暴露出來，使表面疏水性升高。

2.2 TGase交聯SPI表面自由氨基含量的變化

圖2 TGase對SPI自由氨基含量的影響Fig. 2 Effect of TGase cross-linking on the free amino content of SPI

如圖2所示，TGase交聯SPI交聯產物的自由氨基含量降低，自由氨基含量由未交聯的8.12 μmol/g下降到的2.13 μmol/g，下降了73.8%。自由氨基含量降低，原因是TGase催化蛋白質交聯的過程中，使蛋白質肽段上的氨基轉變成NH3釋放出來，發生了脫氨反應；另外一方面原因有可能是TGase的作用使谷氨酸分子上酰胺基與賴氨酸上的氨基發生結合，使交聯產物自由氨基的含量降低。同時自由氨基含量的下降在一定程度上說明了TGase作用后交聯作用的發生程度。

2.3 差示掃描量熱分析

圖3 TGase交聯前后SPI的差示掃描量熱圖譜Fig. 3 DSC thermograms of native and TGase cross-liked SPI

表1 TGase處理前后差示掃描量熱分析Table 1 DSC characteristics of native and TGase cross-liked SPI

由圖3可以看出，T G a s e作用后的變性溫度和熱焓值都有所提高，交聯前S P I的變性溫度為（7 3.7 5±0.1 3）℃，交聯后變性溫度為（76.30±0.22）℃。變性溫度提高反應蛋白的熱穩定性，說明交聯后SPI熱穩定性有所提高。熱焓值交聯前為（176±0.52）J/g，交聯后熱焓值為（193±0.32）J/g，熱焓值能反映蛋白質的疏水性和聚集程度，熱焓值提高，原因可能是酶交聯后蛋白側鏈上特定基團交聯形成更大的分子，產生了大量的高能異肽共價鍵，從而使產物的熱穩定性提高，與Jiang Shujuan等[19]研究結果相一致。從這一結論可以看出交聯可能產生了異肽共價鍵，熱穩定性升高，凝膠強度增強。

2.4 TGase對SPI凝膠結構的影響

圖4 TGase交聯SPI（a～c）和SPI（A～C）凝膠電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of TGase cross-linked SPI (a-c)and native SPI (A-C)

由圖4可以看出，未添加TGase的SPI凝膠的表面光滑，呈球形結構，TGase交聯后結構由球形結構變成凹陷坑洼球形結構。說明TGase對SPI凝膠的內部結構或集團之間的相互作用有著非常重要的調節作用[20]，酶交聯改變的大豆蛋白的表面形貌。Arzeni等[21]利用掃描電鏡觀察高場強超聲波處理大豆蛋白的變化，蛋白質結構表現更加明顯的網狀結構，超聲波處理屬于物理改性，超聲波處理后大豆蛋白的表面形貌改變與TGase交聯表面形貌改變的不同，說明不同的方法處理大豆蛋白對蛋白的結構會有不同的影響。

2.5 X-射線衍射分析

由圖5可知，SPI衍射峰分別出現在衍射角為9.6°和20.2°處，明顯的衍射峰出現在20.2°處；TGase衍射峰出現在衍射角為20.1°處，TGase交聯后SPI衍射峰出現在衍射角為20.2°處；經過酶交聯后SPI，在衍射角為9.6°處衍射峰消失，在衍射角為20.2°處衍射峰強度相對TGase和未交聯的SPI相比較均有所減弱，但峰形變的尖銳；衍射峰能夠形成結晶行為的樣品必須具備有序的分子結構，TGase經SPI交聯后衍射峰減弱。說明SPI經TGase處理后，使SPI結構發生了變化，對SPI微觀晶體結構有所影響。分析原因有可能交聯后蛋白多肽鏈充分伸展，結晶度降低。

圖5 TGase、TGase交聯前后SPI的X-射線衍射圖譜Fig. 5 X-ray diffraction analysis of native and TGase cross-liked SPI

2.6 紅外光譜分析

2.6.1 TGase對SPI紅外圖譜的影響

圖6 TGase、TGase交聯前后SPI紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of native and TGase cross-liked SPI

如圖6、表2所示，SPI 3 600～3 300 cm-1波段的吸回峰值不變，最強吸回峰均為3 409 cm-1，遷移到了3 420 cm-1，遷移了11 cm-1。說明TGase交聯會引起SPI分子內和分子間的氫鍵改變，或O—H伸縮振動、N—H伸縮振動[22]。2 980～2 850 cm-1波段SPI最強吸回峰在2 940 cm-1，TGase交聯后最強吸回峰為2 933 cm-1，酶交聯引起吸回峰遷移7 cm-1，且峰值升高。說明TGase處理后SPI能夠引起蛋白質分子飽和結構中CH3和CH2基團的C—H伸縮振動增強，可能交聯后蛋白質結構展開或進一步斷裂，與X-射線衍射分析相一致。1 700～1 600 cm-1波段，SPI高峰在1 651 cm-1，酶交聯后最高峰在1 633 cm-1，并且吸回峰的強度有所增強。說明酶交聯后酰胺I帶C—O伸縮振動和H—O—H彎曲振動增加。

2.6.2 TGase對SPI二級結構的影響

蛋白質的紅外圖譜中，蛋白質主要包括4 種構相結構，α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規卷曲等。二級結構與各波段吸回峰的位置關系為α-螺旋對應波段l 650～1 658 cm-1，β-折疊為1 610～1 640 cm-1和1 682～1 700 cm-1，β-轉角為1 664～1 681 cm-1，無規卷曲為1 640～1 650 cm-1。酰胺III 1 220～1 330 cm-1波段內蛋白質二級結構與波段對應關系為：α-螺旋為1 290～1 340 cm-1，無規卷曲為1 255～1 288 cm-1，β-折疊結構1 181～1 248 cm-1。如圖6所示，未處理SPI高峰在1 651 cm-1，酶交聯后最高峰在1 633 cm-1，遷移了15 cm-1。這說明SPI經TGase交聯后β-折疊結構含量有較大的提高。分析原因有可能蛋白質二級結構中的一部分α-螺旋結構轉換為β-折疊，形成了穩定的β折疊構造，SPI的二級結構發生了變化。

2.7 圓二色譜分析

從圖7可以看出，SPI和TGase交聯SPI樣品的遠紫外圓二色譜圖在194 nm波長處出現正峰，218 nm波長處出現負肩峰，這是高度有序的β類型結構的一種特征。通過Reed擬合計算，得到2 種樣品的二級結構組成見表3。

表3 TGase交聯前后SPI二級結構的變化Table 3 Secondary structure compositions of native and TGase crossliked SPI

從表3可以看出，TGase交聯前后SPI的二級結構存在一定的差別。與未經過酶交聯的SPI相比，經過TGase交聯后的大豆蛋白有序度更高，無規卷曲結構相對含量較低；而β-折疊相對含量增加，與紅外光譜結果一致，與王辰等[23]的相關研究，表面疏水性隨著SPI的二級結構中α-螺旋相對含量降低而增大，β-折疊相對含量升高而增大的結果相一致。進一步證明了SPI的功能特性與二級結構緊密相關。胡曉[24]利用紅外光譜分析了TGase交聯后花生蛋白的二級結構的變化，得出交聯后α-螺旋和β-轉角含量降低，β-折疊及無規卷曲含量增加，與本研究結果不一致，可能是由于TGase交聯使不同作用底物二級結構發生不同的變化。

2.8 氨基酸測定結果

表4 TGase交聯前后SPI氨基酸的成分及含量Table 4 Amino acid compositions of native and TGase cross-liked SPI

由表4可以看出，SPI中氨基酸含量最高的為天冬氨酸。絲氨酸、組氨酸、脯氨酸等氨基酸的含量有所降低。交聯前后8 種必需氨基酸和疏水性氨基酸比較，必需氨基酸占比由34.96%升高到36.90%，升高了5.5%。分析原因有可能是交聯后蛋白質谷氨酸酰胺基和賴氨酸的氨基之間結合形成含有共價聚合物的交聯，賴氨酸等必需氨基酸被引入SPI中，TGase改善了蛋白質結構和特性，提高了蛋白質的營養價值。疏水性氨基酸占比由31.13%提高到35.63%，提高了14.5%。研究[25-27]表明，蛋白質的表面疏水性顯著影響蛋白質的凝膠性，SPI經酶交聯后，必需氨基酸的含量升高，疏水性氨基酸含量升高。蛋白中疏水性氨基酸的含量與其表面疏水性呈正比例相關，交聯后疏水性氨基酸含量升高說明表面疏水性升高，與表面疏水性一致，進一步證明了疏水性氨基酸含量與凝膠強度正相關。

3 結 論

通過對TGase交聯后SPI的結構變化進行表征，交聯后表面疏水性提高，表明SPI經TGase催化后，使SPI的結構發生了改變，多肽鏈展開，疏水區域從分子內部基團逐漸暴露出來，使表面疏水性升高。自由氨基的含量降低，說明交聯后發生了脫氨反應或使谷氨酸分子上酰胺基與賴氨酸上的氨基發生結合，使交聯產物自由氨基的含量降低。交聯前后掃描電鏡分析，表明交聯后由球形結構變成陷孔狀結構，分子結構發生了改變。X-射線衍射分析表明交聯后多肽鏈充分伸展，空間結構改變，結晶度降低。紅外光譜、圓二色譜對交聯前后二級結構變化進行研究，結果表明交聯后有序度更高，β-折疊相對含量增加，形成了穩定的結構，無規卷曲相對含量降低。而氨基酸含量測定結果表明交聯后引入賴氨酸等必需氨基酸，必需氨基酸占比由34.96%升高到36.90%，疏水性氨基酸占比由31.13%提高到35.63%，交聯后可以提高疏水性氨基酸的含量，改善SPI的表面疏水性，提高β-折疊含量，使凝膠強度增強。本研究結果可以看出，TGase交聯后結構由球形結構變成凹陷坑洼球形結構，與胡曉[24]研究的交聯花生蛋白結構變化不同，說明TGase交聯使不同作用底物二級結構發生不同的變化。TGase交聯SPI后產生了異肽共價鍵，熱穩定性升高，凝膠強度增強，表明選育含疏水性氨基酸高的大豆品種可以提高凝膠強度，為食品加工專用型大豆品種的選育提供了可行的研究思路。