腺相關病毒載體工程研究

潘婷婷，張娟

（中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇南京 211198）

目前已知的許多罕見病，如血友病、杜氏肌營養不良等，都是由特定基因的缺陷導致的。基因療法將治療核酸遞送至靶細胞，可以糾正致病的基因缺陷，持續表達治療性蛋白或沉默有害突變，從而實現長效治療的目的。重組腺相關病毒載體（Recombinant Adeno-Associated Viral Vector，rAAV）因其基因毒性低，可在多種組織中高效長期表達蛋白以及低免疫原性等特性，正逐漸成為基因治療的主要載體。目前，已有3種基于AAV的基因療法分別在歐盟和美國獲批上市，美國食品藥品監督管理局（FDA）的報告預計每年將有10～20種新的細胞治療或基因治療產品上市。

對腺相關病毒（AAV）基因組結構、病毒組裝以及生活周期的深入了解，使得其作為基因療法載體成為可能。AAV為直徑約26 nm的二十面體單鏈DNA病毒，基因組大小約為4.7 kb，共編碼Cap、Rep和aap 3種基因，基因兩端為反向末端重復序列（Inverted terminal repeats，ITRs）。作為基因療法載體的rAAV刪除了所有病毒蛋白的基因，只保留與病毒復制和包裝相關的末端ITR序列，并在ITR之間插入治療性轉基因及必要的表達調控元件，病毒蛋白則以反式作用因子的形式提供。刪除病毒蛋白基因不僅可將AAV攜帶轉基因的容量最大化，還可以減小免疫原性和細胞毒性。由于rAAV載體不表達Rep蛋白，其整合至宿主基因組的能力大幅減弱，從而降低了插入突變引起的基因毒性。rAAV基因組可在細胞核內形成長期存在的環狀串聯體，從而實現轉基因的長期表達。低免疫原性、低基因毒性、衣殼蛋白多樣、作用時間長以及易于生產等特性使得AAV非常適合作為基因療法的載體。

雖然目前AAV載體在臨床上取得了初步的成功，但有關AAV載體轉導效率以及宿主對AAV轉導細胞產生免疫反應的擔憂使得研究者們仍需不斷改造和優化AAV載體結構、衣殼蛋白以及大規模生產工藝，以提高AAV對靶細胞的轉導效率、拓寬靶細胞范圍、避開宿主免疫反應以及提高臨床可及性。本文將對AAV載體和衣殼蛋白工程改造的研究進展進行梳理。

1 重組腺相關病毒載體設計及優化

設計AAV載體時首先需要考慮的是AAV的包裝能力。當AAV基因組小于5 kb時，病毒的包裝效率較高[1]。然而，許多治療性蛋白以及基因編輯核酸酶的編碼序列長度都遠大于5 kb以至于無法有效地包裝進rAAV病毒顆粒中。針對這類情況，除了采用該蛋白的活性截短體外[2]，還可以利用AAV基因組能通過ITR序列或重疊序列之間的同源重組連接成多聯體的特性，將長基因片段分別包裝于兩個或多個AAV載體中以擴大AAV載體能遞送的片段長度。有研究將耳畸蛋白5'部分和3'部分的cDNA編碼序列分別插入兩個含有重組橋接序列的AAV載體中，并在5'-和3'-cDNA后分別引入剪接供體和受體位點，從而實現長達6 kb的外源基因的遞送[3]。這些雙AAV載體的包裝序列有部分重疊，可在細胞內通過分子間重組連接多個AAV載體，然后利用重組序列兩側的剪切信號來精確切除前mRNA中的重組序列，從而得到完整的轉基因片段[4]。還有的研究利用了內含肽（Intein）介導的蛋白反式剪接（Protein transsplicing）將多個AAV載體表達的目的蛋白片段精確連接為全長蛋白[5]。

AAV載體完整的轉導通路包括與宿主細胞表面受體結合，形成內涵體，胞漿運輸，轉運至細胞核/蛋白酶體介導的降解，病毒脫殼，單鏈DNA復制為具有轉錄活性的雙鏈DNA，通過ITR序列重組形成可在細胞核內長期存在的環狀外泌體DNA。因此，除了AAV包裝容量外，AAV衣殼蛋白的嗜性、細胞核轉運的效率以及轉變為雙鏈DNA的效率等，均會影響AAV的轉導效率以及目的基因的表達。其中，雙鏈DNA的合成是目的基因表達的限速步驟。有學者通過突變AAV基因組DNA一端的ITR序列使其成為可自身互補的雙鏈AAV載體（Self-complementary AAV，scAAV），從而避免了雙鏈DNA合成步驟對目的基因表達的影響，然而AAV載體的包裝容量會減少至3.3 kb左右[6]。

AAV表達載體中不同順式作用元件的組合可滿足不同的治療需求。例如，選擇合適的增強子和啟動子來提高轉基因表達水平、實現組織特異性表達等。在多數情況下，rAAV基因表達盒會使用高轉錄活性的組成型啟動子，如巨細胞病毒（CMV）啟動子，來實現目的基因的高表達；表達RNA分子時通常會使用人或鼠的U6小核RNA啟動子和人H1啟動子來驅動短發夾RNA和單鏈向導RNA的表達，以達到基因沉默或基因編輯的目的。其他調控元件，如內含子和土撥鼠肝炎轉錄后調控元件（Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element，WPRE）等，可改善mRNA的轉運及穩定性，從而增強基因表達[7-8]。由于AAV載體包裝能力的限制，載體所使用的順式作用元件需保持較小的尺寸。目前，有研究通過縮短肝特異性啟動子的長度以及結合不同增強子的方法，生成了42種小尺寸的啟動子/增強子組合，在實現有效包裝的同時也提高了組織特異性啟動子的轉錄活性[9]。近年來，有學者使用計算機模擬的方法在全基因組規模上篩選出了長度在41～551 bp，包含進化上保守的轉錄因子結合位點基序簇的14種肝細胞特異的順式作用調節模塊，有助于采用模塊化組裝的策略合理設計肝特異性啟動子[10]。

天然的蛋白基因序列未充分利用宿主細胞的最優選密碼子來表達蛋白，或者轉基因序列GC含量過高，存在隱蔽的剪接位點、轉錄終止信號以及影響RNA穩定性的基序等缺點，均會影響轉基因的表達水平。因此，用于rAAV基因治療的轉基因序列需依據靶細胞的類型進行相應的密碼子優化，以增強轉基因表達水平[11]。

近年來的研究表明，3'端非翻譯區序列（3'untranslated Regions，3'UTR）在結合miRNA、調節mRNA穩定性和翻譯調控等過程中具有重要作用。許多研究發現，在rAAV基因組的3'UTR中引入miRNA122a（在肝中特異性表達）結合位點，可降低轉基因在正常肝組織中的表達，從而實現肝脫靶、減少全身給藥時的rAAV載體用量以及提高基因療法的特異性和療效[12]。上述策略還可用于減少機體對轉基因表達產物的免疫原性，對轉基因產物在體內的長期表達具有重要意義[13]。在3'UTR中引入miRNA142（抗原呈遞細胞中豐度較高）結合位點可顯著減少轉基因在抗原呈遞細胞中的表達，進而避免因機體免疫系統清除表達轉基因產物的細胞，并導致基因療法療效降低[14]。

2 重組腺相關病毒衣殼開發和優化

rAAV載體衣殼蛋白的特性對其細胞靶向性、相關的預存免疫反應以及轉導效率等有重要影響，研究人員通過對衣殼蛋白的改造可賦予其新的功能特性。衣殼開發方法包括天然發現、合理設計、定向進化和計算機發現（in silico discovery）策略[15]。目前，臨床上使用的大多數AAV血清型都是天然來源的，如從人類肝臟組織中分離出的AAV9可以穿越血腦屏障，遞送基因至中樞神經系統中。然而，流行病學數據顯示40%～80%的人有針對人源AAV的中和抗體，這會阻礙AAV載體對靶細胞的轉導。因此，從非人靈長類以及其他脊椎動物中分離出的新型AAV血清型，如AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.43等[16]，可以克服這一問題。然而，天然存在的AAV血清型并不能很好地適應臨床需求，仍需進一步改造和優化。

基于對常用AAV衣殼蛋白結構與功能、與宿主細胞受體的結合以及轉導過程的研究，人們可以通過理性設計的手段改良病毒載體衣殼，提高轉導的特異性和效率。例如，有研究將AAV9中結合多糖受體的基序嵌合到AAV2中來增加AAV2與細胞的結合，提高轉導效率[17]；還有學者利用小鼠體內模型來篩選由隨機核苷酸序列插入到AAV2 VP1的588堿基處構建的AAV展示肽文庫，從而獲得轉導效率高且擁有特定組織特異性的病毒衣殼序列[18]。除了整合特定多肽序列外，有學者通過影響轉導通路，如將暴露在AAV衣殼表面的酪氨酸殘基突變，抑制其磷酸化和泛素化修飾，來減少AAV載體在蛋白酶體中的降解，從而將轉基因在肝細胞中的表達水平提高了 30 倍[19]。

理性設計的方法也只能發現有限的AAV衣殼變體。使用定向進化的手段，可以在不了解AAV載體作用機制的背景下，對不同策略構建的AAV多肽庫進行大規模體外/體內加壓篩選，從而富集有益的衣殼蛋白變體，是一種高效的發現全新AAV載體的方法。構建多樣化的AAV衣殼文庫的方法主要有易錯PCR，基因改組生成嵌合衣殼、特定位點插入隨機多肽片段、衣殼表面高變成環區域的隨機替換[20]。其他定向進化技術還包括蛋白質片段的靶向重組、理性設計與定向進化相結合、基于Cre重組的AAV定向進化（Cre recombination-based AAV directed evolution，CREATE）以及體內定向進化技術，這些技術已被廣泛用于AAV載體的開發[21]。其中，CREATE技術可用于篩選出能有效轉導表達Cre重組酶的細胞且成功轉化為DNA雙鏈的AAV載體。CREATE技術通過將隨機肽段插入到AAV9衣殼的3倍突起部位和在polyA結構中引入Cre重組可逆開關的方法生成AAV衣殼文庫。將AAV衣殼文庫注射能夠組織特異性表達Cre的小鼠后，成功鑒定了可以特異性轉導CNS 的 AAV-PHP.B[22]。

AAV衣殼蛋白庫定向進化的路徑尚未明確，通過體外/動物體內篩選出的病毒衣殼在人體內是否有效仍無法預測，而計算機分析則可以幫助人們理解改良AAV載體的特征。近年來，隨著下一代測序、DNA條形碼標記和人工智能學習等新技術手段的出現，如今研究者們可以系統地對Cap基因全部735個位點的突變體（約20萬種）進行研究，從而更好地指導衣殼蛋白改造工程，確定適合改造的高變區域，加速靶向性AAV載體的發現[23]。有研究運用DNA條形碼標記和高通量測序技術來追蹤定向進化過程中AAV衣殼進化過程，從而幫助人們理解定向進化的機制，加速改良rAAV載體的鑒定[24]。通過對已知衣殼序列的系統進化分析和統計建模，可以預測AAV的進化中間體和祖先衣殼序列，發現衣殼蛋白上高度多樣性和保守性區域，從而為衣殼蛋白的定向進化和理性設計提供參考[25]。

3 結語

體內基因療法治療模式十分廣泛，包括蛋白替代療法、基因編輯、基因沉默等，需要設計出多樣化的rAAV載體滿足不同的臨床需求。盡管rAAV作為基因療法載體在臨床上已取得初步成功，但仍然面臨著許多挑戰，如在人體內的轉導效率低，靶向特性欠佳，大規模生產成本高以及缺少可靠的評估AAV轉導效率的動物模型等。對rAAV載體序列和衣殼蛋白的改造，可以賦予rAAV載體細胞特異性轉導、高轉導效率和轉基因表達水平以及躲避宿主免疫反應等特性。然而，盡管已在體外或動物模型中開發多種AAV載體，但這些載體在人體內是否有效仍無法預測，只能通過開展多項臨床試驗來評估這些載體的安全性和有效性，選出最佳的候選載體。目前，對于腺相關病毒的開發仍處于起步階段，大部分臨床試驗采用的仍是天然來源的AAV載體，未來將會有更多工程化rAAV載體進入臨床試驗階段，也必將會有更多的新技術出現，如人源化小鼠和3D人類組織培養作為篩選和臨床前療效評估模型。基因療法的一大缺點是治療費用高昂，其中一個主要原因就是rAAV大規模生產難度高，因此未來對于rAAV大規模生產工藝的開發將是重點方向之一。