基于細胞培養的動物性蛋白質的生產細胞農業研究進展

李 衛,譚 蒙,孫 莉,張迎慶

(湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068)

人們對肉奶等動物性蛋白質消費需求的日愈增長給地球資源和自然環境造成了很大壓力[1]。大規模的畜禽飼養會對水資源、土地資源造成壓力,畜禽排泄物會對水源、土地及空氣產生污染[2]。此外,傳統畜牧業還存在食品安全問題,例如沙門氏桿菌、大腸桿菌等細菌的污染以及禽流感、瘋牛病、口蹄疫等病毒的感染,這些都極大地威脅著人類健康[3],因此人類迫切需要可持續的動物性蛋白質的生產。

細胞農業是利用細胞培養技術,用比傳統畜牧業少得多的動物或動物源性物質生產動物蛋白,即通過直接培養細胞獲得在營養價值、外觀、味道、物理特性等方面均與動物源一樣的蛋白質產品,如膠原蛋白、蛋清液以及研究最多的“肌肉蛋白質”——培養肉等[4]。研究表明,細胞農業生產培養肉比傳統畜牧業生產牛肉、羊肉、豬肉和禽肉的溫室氣體排放量減少了78%～96%、土地使用量減少了99%、水資源使用量減少了82%～96%、能源使用量減少了7%～45%[5]。通過采用標準化生產方法,細胞農業的生物和疾病風險會顯著降低[6]。由于細胞農業不需要屠宰動物,因此可滿足素食主義者以及那些出于人道而減少肉類攝入的雜食者的需求。此外,細胞農業對氣候、土地質量和面積的依賴程度較低,可以使生活在氣候惡劣、土地貧瘠地區的人們持續地獲得動物蛋白[7]。

細胞農業的研究與開發始于2005年,但其突破性的進展是在2013年以后。2013年Mark Post教授生產出了世界上第一個人工培養的含有原代牛骨骼肌細胞的牛肉漢堡,并在當年8月的倫敦記者招待會上烹制和食用[8]。隨后,總部位于美國的孟菲斯肉制品公司生產出肉丸、牛柳、雞肉和鴨肉等培養肉示范產品,Modern Meadow公司生產出由肌肉細胞與水凝膠結合的高蛋白脫水食品——碎牛肉[9],另一家美國Finless Foods初創公司開展了培養魚的研究[10]。2018年底,以色列宣稱培育出人造牛排[11]。早在2017年中國就與以色列簽署了3億美元的貿易協議,購買其實驗室制備的培養肉[12]。細胞農業按所使用的生產方法可分為兩類,即基于組織工程的細胞農業和基于發酵的細胞農業,它們的共同特征是生產與傳統牲畜業生物等效的產品。基于組織工程的細胞農業是從活體動物身上提取細胞或細胞系,通過組織工程技術產生肌肉等可利用的組織,培養肉的生產即屬于該類[13]。基于發酵的細胞農業是通過使用重組DNA改造的細菌、藻類、酵母等微生物的發酵來生產動物性蛋白質,如明膠、酪蛋白、膠原蛋白等,它利用的是較為成熟的工業生物技術。美國國家科學院將基于細胞培養的動物性蛋白質的生產列為生物科學中具有高增長潛力的領域。2019年人造肉漢堡入選全球十大突破性技術[14]。全球肉奶類替代品市場預計將在2023年增長到64億美元,未來五年培養肉行業的規模將增至100億美元[15]。細胞農業產品與傳統畜牧業產品在營養、味道及口感上幾乎相同,既滿足了消費者吃肉的愿望,又能確保食品安全及飲食營養,還減少了水的消耗、土地的利用、溫室氣體排放及水體富營養化等傳統畜牧業所帶來的環境負擔。因此,細胞農業是一種可替代傳統畜牧業、可持續發展的生產方式。本文探討基于細胞農業進行培養肉等動物性蛋白質的生產過程、關鍵因素、安全監管及發展展望。

1 基于組織工程的細胞農業生產培養肉的過程及關鍵因素

1.1 生產過程

基于組織工程的細胞農業生產肉制品主要是利用動物體內分離得到的種子細胞,通過組織工程技術模擬胚胎肌肉的生成或創傷后肌肉組織的再生[16]。培養肉的生產分為兩個階段:a.細胞擴增階段,即采用貼壁培養或微載體懸浮培養技術,在細胞增殖反應器中使未分化和半分化的細胞增殖以獲得更多的種子細胞;b.分化階段,通過將種子細胞接種到能提供三維生長依托的支架上,在組織灌注反應器中使其生長、分化、發育成肌肉細胞,再通過不斷融合新的肌肉細胞形成多核肌管,多核肌管分化形成肌纖維,最終形成類似肌肉形態和生理特征的組織。培養結束后再將所得的肉糜加工成肉制品[17]。目前制備的培養肉沒有血管和脂肪,肌血球素和鐵蛋白的含量也很少,但與全植物仿肉制品相比,其外觀、味道、口感及質地更近似于傳統肉[18]。

1.2 細胞來源

培養肉的主要細胞來源是原代細胞和基因突變的細胞系。獲得突變細胞系的方式有兩種,一是采用基因工程或化學誘變法獲得無限增殖細胞[19];二是從自發突變的細胞中篩選永生細胞[13]。原代細胞通常是干細胞,包括肌衛星干細胞、胚胎干細胞、間葉干細胞等[20]。肌衛星干細胞是培養肉最常用的細胞來源;胚胎干細胞由于具有無限增值能力也被作為細胞來源,但要使其僅朝著肌肉細胞進行分化比較困難;間葉干細胞因其繁殖能力高并能在無血清培養基中生長而被研究者青睞[21-22]。保證原代細胞在經過多個生產周期后不變異是降低培養肉生產成本的關鍵。最近的研究提出了一些解決方案,例如讓細胞處于缺氧狀態、調節支架參數等[23]。目前對于采用何種動物及取用哪個組織部位的細胞作為最佳的細胞來源仍然是爭論最多的問題。

1.3 培養基的組成及其篩選技術

生產培養肉的培養基由糖類、氨基酸、油脂、維生素、礦物質等組成,在細胞生長的不同時期還需要添加一些生長因子,例如在細胞分化期常加入動物血清或雞胚提取物,因為它們含有激素、脂肪酸、微量元素、胞外囊泡等多種生長因子[17,21,24]。由于含血清等動物源成分的培養基會產生污染、重復性差以及監管等方面的問題,因此開發無動物源成份的培養基是目前的研究熱點[25]。細胞農業所用培養基十分昂貴,尚不能用于大規模的細胞農業生產,因此獲得廉價培養基是細胞農業急需解決的問題。現在研究人員開發出一種多孔微流體裝置,通過并行處理成百上千個不同組分的培養基并采用自動圖像分析技術,能極大地加快培養基的篩選及研發過程[26]。

1.4 組織支架

為了模擬肌肉生長的天然環境、增強細胞的生長和分化、促進肌肉纖維的形成并使肌肉細胞附著其上生長,需要在反應器內放置支架。現今大多數成功制成的肉制品都是在動物來源的膠原蛋白支架上生長的,因其更接近肌肉的天然生長環境。為了生產高度結構化和組織化的培養肉,需要采用灌注法制備具有立體網絡通道的支架,使液體能在整個網絡組織中流通灌注,例如研究人員采用3D打印機制成的灌注網絡支架能維持六周的細胞培養[27-29]。關于支架制造需要解決的問題還很多,例如制備可食用支架使其成為肉制品的一部分,制備可降解的支架,制備易與培養肉分離的可重復使用支架,用食品級非動物來源或動物源的生物材料制備支架等[30-31]。

1.5 生物反應器

要使培養肉在價格上能被消費者接受,首先必須提高反應器體積以降低生產成本。研究表明,反應器體積放大100 倍,可使單位產量的設備成本降低到原來的15.8%[32]。其次,細胞培養密度也要比目前動物細胞培養高一個數量級。這對于組織工程來說將是前所未有的挑戰,因為高密度、大規模的細胞培養需要生長因子及營養物質的快速補充、氧氣的充足供應以及代謝廢物的快速排放[33]。

傳統攪拌釜式或鼓泡塔式反應器只能生產碎沫肉,要想生產出高度結構化的培養肉(如整塊牛排)需要采用“三維支架+灌注”式反應器。然而,由于其放大存在很大困難并不適合培養肉的大規模生產[34]并且隨著“三維支架+灌注”式反應器內流動尺度的增加,灌注營養液產生的阻力會升高,甚至會在某些區域超出細胞的承受力而造成細胞死亡;對于大型“三維支架+灌注”式反應器來說,采用低灌注流速時其內部溶氧、溫度、pH以及營養物傳輸和代謝廢物的積累均會出現不均勻,而高灌注流速會導致剪切應力過高對細胞造成傷害[32]。因此,“三維支架+灌注”反應器的工程放大是培養肉產業化所面臨的重要問題。

2 基于發酵的細胞農業生產動物性蛋白質

2.1 生產過程

基于發酵的細胞農業生產動物性蛋白質的過程與重組蛋白生產過程類似。首先將能表達所需蛋白質的基因導入宿主細胞,然后將此基因改造的宿主細胞置于裝有培養基的生物反應器中生長繁殖,宿主細胞據該目標基因表達出對應的蛋白質,最后將產生的蛋白質與宿主細胞分離并對分離出的蛋白質進行純化[35]。

基于發酵的細胞農業生產所用菌株與生產重組蛋白酶的菌株相似,因此可直接借鑒重組蛋白酶的研究成果及生產經驗,例如蛋白質改性的精確控制、蛋白質的高效折疊等,這能極大地促進細胞農業的研發[36]。酵母菌、絲狀真菌等長期安全地用于食品工業的微生物也正在被開發成細胞農業生產的宿主菌株。

2.2 生產特點及存在問題

基于發酵的細胞農業生產出的動物蛋白的分子量通常很大,由許多重復單元和亞基組成,在基因改造的非原生宿主細胞內,將它們進行最后組裝十分困難,因此開發出能表達和組裝復雜蛋白分子的微生物是現今面臨的挑戰。

與重組蛋白不同,基于發酵的細胞農業生產的蛋白質通常積累在細胞內而不是分泌到培養基中,這使得這類產品更易受到宿主細胞殘骸的污染,產品的分離純化變得更加困難。如果選擇出能產生所需風味的宿主細胞且對產品純度要求不高,將大幅降低細胞農業的生產成本。例如,釀酒酵母中含有能產生乳酪風味的菌株,將此菌株用于生產酪蛋白,存在于酪蛋白粗提物中的殘留酵母細胞將對最終乳酪產品的風味具有重要貢獻[37]。

2.3 生產的產品種類

目前,基于發酵的細胞農業生產的動物蛋白包括明膠、酪蛋白、膠原蛋白等,這些蛋白可以用于食品、皮革、生物醫學和化妝品領域,如酪蛋白可用來制備牛奶,明膠可用來制備蛋清液,膠原蛋白可用來制備皮革、生物材料以及作為化妝品原料等。目前已有用發酵法生產出蜘蛛絲樣的膠原蛋白用于紡織和生物材料方面的應用[37]。

基于發酵的細胞農業生產的動物蛋白的純度通常要求不高,但不能含有活菌及抗性基因。考慮到成本因素,可以僅將對產品功能起重要作用的蛋白質用細胞農業生產的蛋白質取代,其它則由植物成分代替。例如,生產蛋清液只需包含10%的發酵法生產的蛋白質,其余部分用植物或藻類膠質物代替,即可生產出與天然蛋清差不多質地、功能、風味和營養成分的產品。將發酵法生產的動物蛋白與植物來源的蛋白質、油脂等結合,可生產出比全植物的仿制肉更接近動物肉制品的產品,并且可按需調節仿制肉中所含的營養組分,例如可以將其中含量較多的且對身體有害的ω-6脂肪酸用對身體有益的ω-3脂肪酸代替。

3 細胞農業生產的安全監管

3.1 培養肉的安全監管

2018年10月美國農業部食品安全與檢驗局(FSIS)和美國食品藥品監督管理局(FDA)舉行聯合會議,就來自畜禽細胞培養食品的潛在危險、監督管理等方面進行討論[38]。FDA認為細胞培養的可食性產品成分并不需要新的批準許可,因為現有的指南已經能夠完全涵蓋細胞培養的各種組分、外源性試劑、生產工藝等,而且作為食品成分的培養細胞及其代謝產物已經通過GRAS(Generally Recognized as Safe)安全認證并具有長期的安全消費歷史。

有學者認為將培養肉與傳統畜禽肉實質等同的監管模式是不合適的,作為安全審查的一部分,應該找到一些方法來確定培養肉是否符合與畜禽肉實質等同或無實質差異的標準[39],認為對培養肉的監管方式應該取決于其生產方式。歐盟于2015年修訂的管理條例中也廢除了實質等同的監管模式,而將危險性評價等預防性措施作為優先考慮因素[4]。

培養肉的安全監管涉及一系列管理部門。在歐洲,畜禽供體的養殖及其細胞的提取和檢驗涉及到動植物衛生署、食藥局、環境部、農村事物部及當地政府機構等多個部門。培養肉本身也需要食藥局、當地環境健康部門、貿易標準部門及當地政府機構的監管。為減少監管的復雜性,提倡采取主要權力模式,即在該領域具有專業資質的一家地方機構為代表行使其監管權力[40]。美國的FSIS和FDA簽訂了一項協議,以規范管理來自家畜細胞及細胞系的細胞培養食品,由FDA負責監管細胞采集、細胞庫、細胞增殖和分化,而FSIS負責監管細胞收獲、后續加工及銷售等[41]。

由于細胞取自動物活體,因此建立動物福利法案十分必要[42-43]。目前關于供體細胞標準參照的是人體組織細胞醫學管理條例,需要對其進行修訂使其適用于培養肉生產。細胞農業生產肉制品是細胞培養技術與肉類科學的結合,在安全監管上應包括以下內容:關鍵致病菌的鑒定及防止污染的安全措施,確保肉的老化時間在24 h以上以使所有細胞死亡,監測每一階段細胞的質量及功能(包括細胞效力的評價、基因穩定性檢測等),代謝廢物的處置及回收利用,生產車間的危險性及可操作性管理等[44-45]。

對于培養肉與傳統畜禽肉混合的肉制品,應防止弄虛作假亂標兩種肉比例的情況。研究人員正在開發一種適用于培養肉的蛋白質跟蹤器,以方便快捷地追溯和檢測肉制品出處及成分等。此外,還需要對采用非農業畜禽物種生產的產品進行監管,如瀕危動物、危險動物、寵物、陪伴動物等,對于這種形式的細胞農業生產需要從社會倫理、安全性等方面考慮其許可性及進行必要的保護[46]。

3.2 基于發酵的細胞農業安全監管

有學者認為基于發酵的細胞農業生產的動物性蛋白質與來源于傳統畜牧業的蛋白質沒有實質性差別。盡管其采用的是基因改造的微生物,但自然界生物體間基因轉移現象十分普遍,例如幾乎所有品種的甘薯都有來自土壤的微生物基因[47],且細胞培養產品已有多年的安全使用歷史,如各種食用真菌、藻類、酶類以及胰島素等醫藥產品,所以認為基于發酵的細胞農業生產的動物蛋白是安全的。

基因改造的微生物可能會對環境造成污染及危害,需要對這些微生物進行有效滅活,在運輸、操作及衛生等方面應采取特別的安全防范措施,使生產過程中每一步的危險性降到最低[37]。為了規范化管理微生物種類及基因改造類型,生產企業應向相關管理機構提供產品生產安全告知書,告知書內容包括生產所用菌株、生產工藝及流程、培養基成分等。

4 細胞農業發展展望

細胞農業領域目前處于創建初期,為了促進細胞農業的研發,有必要建立學術界和產業界的聯盟以確保研究初期就以大規模生產為首要考量,并將生產企業定位為學術研究成果的接受者。此外還要促進生產企業、研究人員、供應商之間的溝通和交流,以減少重復工作并最大限度地利用知識產權許可降低投資風險。

細胞農業需要解決的問題還很多。在培養肉生產方面,期望在分化階段獲得高度結構化的肌肉組織,以期得到特有質地和口感的肉制品,這方面還沒有突破性進展;肌肉組織在畜禽體內的生長通常需要血管來提供營養物質,還會受到來自神經和畜禽活動等多種因素的影響;這些都是目前體外培育細胞無法達到的[48-49],這將是今后培養肉研發的重要方向。

與傳統畜牧業相比,細胞農業生產培養肉仍有其獨特的優勢,例如珍稀動物肉制品的生產只需提取少量細胞,從而減少了對珍稀物種的捕殺。利用細胞培養技術還可選擇性地生產營養和風味更佳的肉類產品,例如減少肥肉細胞的合成比例、增加瘦肉細胞的合成比例等[50]。

細胞農業也為傳統畜牧業提供了新機遇,從收獲畜禽體到收獲細胞的轉變就是從選擇并利用高產量雜交品種的基因組和表型轉向利用能在低密度、低投入的廣泛系統中茁壯成長的更傳統的畜禽,這種轉變不僅有助于保留傳統品種的遺傳基因,保護生物多樣性,且對環境的影響小,生產利潤高。相信在不久的將來細胞農業會成為一個具有巨大商業利益和發展潛力的領域。