日糧添加表沒食子兒茶素沒食子酸酯對雞肉品質(zhì)和非酶抗氧化能力的影響

黃莉，曹愛華，丁波，張韓杰，王彥美，孫春龍，孫京新

1(濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州，256600) 2(山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州，256600) 3(日照市疾病預(yù)防控制中心，山東 日照，276826) 4(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266109)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallo-catechin gallate，EGCG)是兒茶素中最有效的抗氧化成分，在綠茶中大約占9%～13%[1-2]。兒茶素具有較強的清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗菌等功能[3]，被廣泛應(yīng)用于肉制品加工或添加于動物日糧中[4-5]。兒茶素對肉制品的色澤、保水性等品質(zhì)都有明顯的作用，如將兒茶素添加到豬肉糜中，可以抑制豬肉糜中肌紅蛋白和脂肪氧化的速度，改善肉色，且效果優(yōu)于抗壞血酸，但降低了豬肉糜的保水性和嫩度[6-7]。兒茶素還可以添加于動物飼料中以增強肉的抗氧化能力[8-9]，改善肉的品質(zhì)[10-12]。將茶多酚添加于羊飼料中可以抑制羊肉的脂肪氧化程度，降低肉的滴水損失并提高羊肉的顏色穩(wěn)定性[12]。氧化反應(yīng)影響了肉的品質(zhì)，但在動物活體時就已經(jīng)存在，在動物日糧中添加抗氧化劑可以提高機體及肉的抗氧化能力，如在豬日糧中添加茶多酚，能顯著提高肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及總抗氧化能力，降低豬肝臟中GSH-Px、過氧化氫酶等基因表達量[13]。將EGCG添加在鵪鶉的日糧中，能降低其肝臟中的脂肪氧化程度，增加抗氧化酶和解毒酶的活性[14]。日糧添加兒茶素可以提高動物機體的抗氧化酶活性已被證實，但其對動物的非酶抗氧化能力還不明確。將甘草提取物添加到灘羊飼料中可以顯著地降低活性氧自由基含量及硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)[15]；向豬日糧中補充過江藤可顯著增加豬肉中的維生素E(vitamin E，VE)含量并增強豬肉的脂肪氧化穩(wěn)定性[16]。將兒茶素添加于羊的日糧中，可以增加羊血漿和肉中還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量[17]，保護羊骨骼肌免受氧化脅迫。VE和GSH是非酶類抗氧化體系的重要組成部分，但添加EGCG對肉中VE、GSH含量及清除自由基的能力還鮮有報道。

本實驗研究日糧中添加EGCG對雞肉中VE和GSH含量、抗氧化能力、保水性和肉色的影響，以期揭示EGCG對動物的非酶抗氧化體系的影響，為畜牧業(yè)和肉品加工中控制氧化、提高肉的品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白羽雞：選擇150只14日齡白羽肉雞，先飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境，再將其隨機分成5組，每組10只，飼喂于山東綠都生物科技有限公司。從第21～42天，分別向雞日糧中添加氧化油脂和EGCG，并將其分組。第1組為氧化油脂組，飼料中混合質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的花生油(花生油在100℃氧化大約3 d，其POV值在30±3 mmol/kg)；第2組為氧化油脂+EGCG組，在飼料中混合5%的花生油并添加100 mg/kg EGCG；第3組為VE組，在飼料中添加200 mg/kg VE醋酸酯(純度98%)作為陽性對照組；第4組飼料中僅添加EGCG，為EGCG組；第5組只飼喂飼料，不添加抗氧化劑，作為空白對照。第43天將肉雞宰殺后取雞胸肉和雞肝，真空包裝后用保溫箱加冰運回實驗室；24 h開始制樣。

EGCG、VE醋酸酯、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,南京道斯夫生物科技有限公司；谷胱甘肽(GSH)試劑盒,南京建成生物工程研究所。鄰苯三酚、二氯甲烷等試劑均為分析純，濱州泰達儀器試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型液相色譜儀，日本島津公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛明儀器有限公司；T25型高速分散器，德國IKA；TG18型高速臺式離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；HZQ-X300G型恒溫振蕩器，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞肉樣品處理

取氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組的雞胸肉，待其解僵后使用絞肉機絞碎，粒度直徑為 5.6 mm，混勻后裝袋，每組樣品50 g，共18袋，真空包裝于4 ℃冰箱中冷藏。在0、1、3、7、14、21 d每組樣品中取3袋，檢測其TBARS、羰基值、保水性和高鐵肌紅蛋白值。

1.3.2 TBARS和羰基含量的測定

TBARS的測定參照SINNHUBER等[18]的方法，羰基含量的測定參照XIA等的[19]的方法。

1.3.3 雞肉持水性的測定

根據(jù)LIU等的方法并稍作修改[20]。取絞碎的雞肉5 g在4 ℃下2 000×g離心20 min，并在105 ℃下干燥至恒重。持水性被定義為損失的汁液，計算如公式(1)所示，

(1)

式中:W0，W1和W2分別表示肉餡離心前的質(zhì)量(g)，離心后的質(zhì)量(g)和干燥后的質(zhì)量(g)。

1.3.4 高鐵肌紅蛋白含量的測定

參照PREDESCU等[7]的方法并略作修改，取2.0 g肉糜放入離心管中，加入20 mL 40 mmol/L pH為6.8的冷磷酸鹽緩沖溶液，混合物均質(zhì)后,在4 ℃下4 500 r/min離心30 min，取上清液在400～700 nm之間比色，高鐵肌紅蛋白含量的計算如公式(2)所示。

高鐵肌紅蛋白含量/%=(-2.514R1+0.777R2+

0.800R3+1.098)×100

(2)

式中，R1=A572/A525，R2=A565/A525，R3=A545/A525

1.3.5 雞胸肉及細胞膜中VE含量的測定

樣品中VE含量的檢測參見GB/T 9695.30—2008 肉與肉制品VE含量測定。雞肉中細胞膜提取：取雞胸肉組織勻漿液(100 g/L)3 000 r/min離心10 min，取沉淀加生理鹽水，4 850 r/min離心15 min得細胞膜。分析條件：色譜柱：C18柱(4.6 m×250 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=96∶4；柱溫：室溫；流速0.8 mL/min；檢測波長294 nm；進樣量20 μL。

1.3.6 谷胱甘肽含量的測定

準(zhǔn)確稱取雞胸肉和雞肝，打碎，加入9倍或5倍體積的0.9% 的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，取100 g/L的雞胸肉勻漿液和雞肝勻漿液各1 mL，2 500～3 000 r/min,離心10 min,取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作測定樣品的谷胱甘肽含量。

1.3.7 雞肉提取液及其抗氧化能力檢測

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1 (分析軟件，St Paul,MN) 軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用sigmaplot 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對雞肉脂肪氧化和蛋白氧化的影響

脂肪氧化的次級產(chǎn)物可通過TBARS值表征，TBARS值與肉類脂肪氧化程度呈正相關(guān)性。如圖1-a所示，隨著冷藏時間的延長，各組雞肉的TBARS均呈顯著增加趨勢(P<0.05)，但增加程度不同。氧化油脂組TBARS增加速度最快，經(jīng)過21 d貯藏，TBARS從0.10 增加到0.65 mg MDA/kg，而VE組增加速度最慢，從0.09增加到0.45 mg MDA/kg。與空白組相比較，VE組和EGCG組的TBARS分別降低了17.9%和11.8%；與氧化油脂組相比較，VE組和EGCG組的TBARS分別降低了31.1%和25.9%，說明隨著冷藏時間延長，雞肉的脂肪氧化程度不斷加深，EGCG與VE一樣抑制雞肉的脂肪氧化程度，減少脂肪氧化產(chǎn)物的生成。TANG等也證實飼喂肉雞茶多酚可以提高雞肉在凍藏過程中的氧化穩(wěn)定性[23]。肉在加工或貯藏過程中，由于光線、金屬離子等作用，會誘導(dǎo)脂肪氧化，EGCG可以抑制脂肪氧化產(chǎn)物的生成，可能與其結(jié)構(gòu)富含OH·基團有關(guān)，可以清除脂肪氧化過程中產(chǎn)生的自由基并清除金屬離子[24]。

蛋白羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后一個顯著變化，因此羰基被廣泛地用于測量蛋白質(zhì)的氧化程度。從圖1-b可以看出，隨著冷藏時間的延長，蛋白中羰基含量顯著增加(P<0.05)。羰基含量與TBARS呈現(xiàn)相似的增加趨勢。貯藏0 d的樣品中肌原纖維蛋白中羰基含量為1.47～1.78 nmol/mg蛋白，這個結(jié)果與MORZEL從新鮮的豬背部最長肌中提取的肌原纖維蛋白(1.70 nmol/mg蛋白)的羰基含量相接近[25]。與0 d相比較，當(dāng)貯藏到21 d時，氧化油脂組、氧化油脂組+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組樣品中羰基含量分別是冷藏0 d時的2.02、1.71、1.70、1.66、1.83倍，在相同的凍藏時間內(nèi)，EGCG組和VE組的所有樣品中羰基含量均顯著低于氧化油脂組和空白組(P<0.05)。TBARS與羰基之間具有相關(guān)性，脂肪氧化產(chǎn)物會引發(fā)蛋白氧化產(chǎn)生更多的羰基[26]，隨著冷藏時間的延長，雞肉中脂肪氧化產(chǎn)物增加，因此羰基的含量迅速增加。

2.2 EGCG對雞肉在冷藏過程中保水性的影響

肉的保水性是指當(dāng)肌肉受外力作用時保持其原有水分與添加水分的能力，是肌肉食品品質(zhì)評定的重要指標(biāo)之一。如圖2所示，隨著冷藏時間的延長，雞肉的保水性呈現(xiàn)先增加再下降的趨勢，VE組和EGCG組的保水性明顯高于氧化油脂組和空白組(P<0.05)。冷藏0 d時，各組樣品的保水性值為89.6%、88.8%、91.7%、91.3%和90.5%，冷藏1 d，保水值略有增加，貯藏至21 d時，與貯藏0 d相比較，保水性分別下降了28.7%、22.9%、18.5%、20.5%和23.5%，說明EGCG有利于改善雞肉的保水性。抗氧化劑可以間接地影響肌肉的保水性，保水性的高低取決于肉的pH值和脂質(zhì)的氧化程度[27]。脂肪氧化可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致肌肉纖維收縮、降低肌肉的保水性，如豬肉在Fe2+/H2O2體系中氧化后，肌球蛋白和肌動蛋白會同時收縮并伴有肌漿蛋白的變性，這種蛋白質(zhì)之間的相互作用是導(dǎo)致肌肉保水性下降的根本原因[21]。

2.3 EGCG對雞肉在冷藏過程中高鐵肌紅蛋白含量的影響

氧化會導(dǎo)致肌肉顏色的改變，通過肉色的改變可以判斷肌肉食用品質(zhì)的變化。肌紅蛋白是宰后肌肉的主要呈色物質(zhì)，肌紅蛋白氧化后會生成高鐵肌紅蛋白，使肉褪色。如圖3所示，隨著冷藏時間的延長，各組高鐵肌紅蛋白的相對含量呈上升趨勢。當(dāng)貯藏0 d時，氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組中高鐵肌紅蛋白相對含量分別為17.3%、16.4%、14.8%、15.3%和15.9%，當(dāng)貯藏21 d時，高鐵肌紅蛋白相對含量分別增加至53.4%、45.7%、40.4%、43.1%和50.3%，VE組的高鐵肌紅蛋白含量增幅最小，EGCG組次之，說明VE和EGCG能有效地抑制高鐵肌紅蛋白的生成，抑制肉的褐變。

脂肪氧化與肌紅蛋白氧化密切相關(guān)，脂肪氧化過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物自由基可以誘導(dǎo)氧合肌紅蛋白的氧化，脂肪氧化是一個耗氧的過程，氧分壓的降低有利于高鐵肌紅蛋白的生成[28]。一般情況下，當(dāng)高鐵肌紅蛋白含量低于20%時，肉呈現(xiàn)鮮紅色；達到30%時肉色變暗；當(dāng)含量超過50%時肉色呈現(xiàn)紅褐色。由于雞肉屬于“白肉”，顏色淺紅，所以貯藏至21 d時，隨著高鐵肌紅蛋白含量升高，雞肉的顏色呈黃色。

2.4 EGCG對雞肉及細胞膜中VE含量的影響

動物機體抵御各種活性氧自由基的抗氧化防御體系包括抗氧化酶體系和非酶類抗氧化防御體系，前者包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶和GSH-Px；后者包括脂溶性、水溶性的抗氧化劑，如VE、GSH以及微量元素(硒、鋅等)。VE是機體非酶抗氧化體系的重要組成之一。因此，檢測雞肉中VE含量有助于分析EGCG對雞肉非酶抗氧化體系的影響。向動物日糧中添加抗氧化物質(zhì)可以增加肉中的VE含量[17]，進而提高肉在加工及貯藏過程中的抗氧化能力。如圖4所示，氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組雞肉中VE含量分別為2.24、2.43、5.46、3.91、2.75 μg/g肉，相應(yīng)地，各組細胞膜中VE含量分別為0.565、0.703、1.235、0.774、0.677 μg/g肉。由此可以看出，氧化油脂組中VE含量最低，而VE組中VE含量最高，其次是EGCG組，空白組的VE含量高于氧化油脂組。細胞膜中的VE含量與肉中的VE呈現(xiàn)相似的趨勢，各組之間差異顯著(P<0.05)。VE主要存在生物膜中，能有效阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制生物膜脂質(zhì)過氧化。VE和抗氧化劑能維持肌肉細胞膜的完整性，避免氧化物造成的損傷。VE組和EGCG組VE含量顯著高于其他組別(P<0.05)，這可能是因為日糧中添加VE或抗氧化劑可以降低動物機體對VE的利用；氧化油脂組和氧化油脂+EGCG組中VE含量低，可能是由于機體中VE因清除氧化油脂帶入的活性氧自由基而導(dǎo)致其含量下降。

EGCG具有較強的自由基清除能力和螯合金屬離子的能力，將其直接添加在食品中，清除脂質(zhì)過氧化物的能力優(yōu)于VE[29]，所以日糧中添加EGCG可以清除脂肪氧化產(chǎn)生的自由基，抵減促氧化劑的作用，保護VE免受氧化損失[30]，VE也可在體內(nèi)蓄積導(dǎo)致其在肉中含量增加，這個結(jié)果也有助于解釋VE組和EGCG組雞肉在冷藏過程中具有較好的氧化穩(wěn)定性。劉旭升等也證實在雞日糧中添加綠茶粉可以有效地提高雞肉中VE的含量[31]。

2.5 EGCG對雞肉中GSH含量的影響

谷胱甘肽(GSH)是動物機體中非酶抗氧化防御體系的一個重要指標(biāo)，其生理作用是能夠清除動物機體的自由基，有助于抵御氧化應(yīng)激。因此，動物體內(nèi)的GSH含量越高，說明機體的抗氧化能力越強。如圖5所示，氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組雞肉中GSH含量分別為3.31、3.73、5.14、4.84、4.43mg/g蛋白質(zhì)，差異顯著(P<0.05)；而在肝臟中，各組的GSH含量依次分別為17.4、20.5、25.7、21.2和18.6 mg/g蛋白質(zhì)，與肉中GSH含量具有相似的趨勢，且VE組和EGCG組GSH含量較高。唐雪蓮等證實添加維生素E可以增加羅非魚肉中GSH含量[32]。在豬日糧中添加綠原酸，也可增加肉中GSH的含量。本研究結(jié)果說明EGCG與VE均可以增加肉中GSH的含量。

2.6 雞肉提取液的自由基清除能力

自由基具有高度的活潑性和極強的氧化反應(yīng)能力，可以與蛋白質(zhì)、脂肪等分子作用發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肉制品品質(zhì)下降。利用石油醚抽提氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組、VE組、EGCG組和空白組樣品所獲得的提取液，其對DPPH·、超氧陰離子、羥基自由基的清除能力和亞鐵離子還原能力如表1所示。由表1數(shù)據(jù)可知，VE組和EGCG組清除DPPH·、超氧陰離子、和羥基自由基的能力顯著高于氧化油脂組、氧化油脂+EGCG組和空白組(P<0.05)，EGCG組的亞鐵離子還原能力顯著高于氧化油脂組合空白組(P<0.05)。樣品提取液之所以具有抗氧化作用，可能是因為提取液中含有多酚或其代謝產(chǎn)物，或脂溶性的維生素E或其他抗氧化物質(zhì)。多酚在動物體內(nèi)可能會分解成具有抗氧化作用的產(chǎn)物，或者像VE一樣以原物質(zhì)形式存在于肉中，或者影響其他具有抗氧化物質(zhì)的含量等，但這些作用還不明確。ORTUO等發(fā)現(xiàn)羊日糧中添加迷迭香二萜類化合物(鼠尾草酸和卡諾醇)，鼠尾草酸可以其代謝產(chǎn)物C19H22O3蓄積，使羊肉表現(xiàn)出良好的自由基清除能力和亞鐵還原能力[33]。EGCG是水溶性植物多酚，經(jīng)過新陳代謝會以哪種形式存在，提取液中究竟含有哪些物質(zhì)還需進一步研究。

注：大寫字母A-D為同一處理組之間的比較。

3 結(jié)論

EGCG是茶多酚中水溶性的、抗氧化活性最強的成分。日糧添加EGCG可以提高雞肉在冷藏過程中的氧化穩(wěn)定性、雞肉的保水性，并改善肉色。EGCG可以保護肉中的VE并增加其在肉中的含量、增加肉中GSH含量，添加EGCG的雞肉的提取液具有較強的清除DPPH·、超氧陰離子、羥基自由基能力和亞鐵離子還原能力。因此，日糧中添加EGCG，可以提高雞肉的非酶抗氧化能力，對提高雞肉在加工及貯藏過程中的品質(zhì)具有重要作用。