八月瓜的化學組成、抗氧化性及α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

羅宗洪，蔡圣寶，易俊潔*

1(昆明理工大學 農業與食品學院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

糖尿病是嚴重危害人類身體健康的慢性疾病之一，許多臨床研究證明氧化應激與糖尿病及其并發癥的發生、發展緊密相關[1]。氧化應激的標志物主要為自由基，一般當機體在遭受各種有害刺激時，自由基的產生和抗氧化防御之間嚴重失衡，從而導致機體組織損傷[2]。目前，通過應用天然抗氧化劑清除自由基，治療可逆轉氧化應激對機體的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發癥的出現，成為研究者們關注的熱點。

α-葡萄糖糖苷酶是位于小腸消化碳水化合物的關鍵酶，也是引起餐后血糖升高的主要酶之一[2]。有效抑制α-葡萄糖糖苷酶的活性，可以降低餐后血糖，調節糖脂代謝，緩解糖尿病及其并發癥的出現[3]。目前,在國內糖尿病藥物市場中應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為通過生物合成或半生物合成的藥物，不僅種類少、副作用大，而且價格昂貴[4]。因此，從天然藥食同源植物中提取具有一定活性的小分子化合物，研發既經濟又有良好治療效果的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的意義。

八月瓜(Akebiatrifoliata)，俗稱“野香蕉”，在中醫學中稱為預知子，屬于三葉木通科木通屬木質藤本半常綠纏繞植物，主要分布在云南、貴州、湖南、河南一帶，其中以云南昭通、貴州銅仁、湖南張家界、四川雅安居多[5]。農歷八月到九月瓜熟開口，果皮呈紫色，種子可榨油。八月瓜營養豐富，富含三萜類皂苷(含有齊墩果酸，熊果酸等)、必需氨基酸(如纈基酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等)、多糖、維生素C(VC)、甾醇和微量元素等[5-6]。張亞平等[7]報道八月瓜提取物對肝損傷具有一定的保護作用。任紅艷等[8]和LU等[9]均發現八月瓜提取物具有顯著的抑制肝癌細胞增長的功效，尤其是八月瓜籽。但對八月瓜的植物化學組成、抗氧化性以及對α-糖苷酶活性抑制效果的研究較少。因此，本研究以探究八月瓜活性成分抑制糖尿病為目的，首先通過超高效液相色譜-質譜聯用儀定性分析八月瓜果皮和種籽提取物中植物化學組成，并確定其總酚、總黃酮、總皂苷等功能性成分含量，另外，對比果皮和種籽提取物的抗氧化活性和α-糖苷酶活性抑制能力，為八月瓜資源的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八月瓜鮮果,云南省昭通市彝良縣市場;DPPH、ABTS自由基、蘆丁、沒食子酸,Sigma-aldrich公司;色譜乙腈和Folin-Ciocalteu,Merck公司。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000超高效液相色譜儀、Q-Exactive Focus軌道離子阱高分辨質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Reprospher 100 C18柱，德國Dr.Maisch公司。

1.3 原料前處理

將購買的新鮮八月瓜在陽光充足的條件下晾曬3～5 d，然后將曬干的八月瓜進行果皮與種籽分離，分別標記裝袋。用食品級打粉機將曬干的果皮和種籽分別打成粉末，裝袋置于4 ℃冰箱內保存待用。利用石油醚進行脫脂，用80%(體積分數)甲醇抽提。將抽提出的液體部分利用真空泵濃縮，將濃縮的提取物置于凍干機中凍干備用。

1.4 超高效液相色譜質譜聯用儀定性分析提取物成分

用高分辨液質聯用儀檢測八月瓜果皮和種籽的酚類物質組成。采用Reprospher 100 C18柱，以0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，流動相的體積濃度梯度為：0～5 min,10% B;5～15 min,10%～15% B;15～25 min,15%～35% B;25～30 min,35%～50% B；30～32 min,50%～100% B。進樣量為3 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫設為30 ℃。

ESI-HRMS/MS檢測時使用模式為陽離子模式，掃描范圍m/z150～2 000。果皮和種籽中酚類化合物的二級譜圖信息是由Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer檢測器檢測得到。其余質譜參數設置如下：分辨率70 000；鞘氣流速32 L/min；輔助氣體流速8 L/min；噴射源電壓3.3 kV；S-lens射頻水平50%；輔助氣體加熱器溫度350 ℃；毛細管溫度320 ℃。

1.5 總酚含量的測定

用福林酚法測定八月瓜果皮和種籽的總酚含量[10-11]。分別取樣品4 mg用8 mL 80%(體積分數)甲醇溶解并稀釋5倍。然后取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL福林酚試劑。靜置1 min。隨后加入1.5 mL Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL。混勻，70 ℃水浴中孵育10 min，用酶標儀測定765 nm處的吸光值。總酚的標準曲線以沒食子酸為當量，將沒食子酸稀釋成5個不同濃度，按照以上步驟，測定反應后的吸光值并繪制標準曲線。

1.6 總黃酮含量的測定

總黃酮的含量測定方法參照前人[12-14]研究方法并進行部分改動。分別取樣品4 mg溶于8 mL 80%甲醇并用80%甲醇稀釋5倍制得樣液。取1 mL配制好的樣液用70%乙醇定容至2.5 mL，加入0.15 mL 5%(質量分數)的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min。再加入0.15 mL 10%(質量分數)的Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min，最后加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液。混勻，室溫下靜置3 min，用酶標儀測定500 nm處吸光值。總黃酮的測定用蘆丁作為參照物，將蘆丁稀釋成5個不同濃度，按照以上步驟測定并繪制標準曲線。

1.7 總皂苷含量的含量測定

總皂苷的測量方法參照前人測定三七皂苷的方法[15-16]。以空白試劑做參比，于548 nm處測定吸光度[8]，并繪制標準曲線。

1.8 DPPH抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定的方法參考李安林等[17]的方法并稍作修改。首先取0.5 mL八月瓜樣品，然后加入2.0 mL的DPPH(0.1 mmol/L)試劑后，暗處放置30 min，然后在517 nm波長下測定反應液的吸光值A1。同時，用0.5 mL甲醇替代樣品加入到2.0 mL DPPH 試劑中，于相同條件下測定其吸光值A2。實驗標準品選用VC做對照試驗，按照以上步驟進行實驗。八月瓜提取物對DPPH自由的清除能力按公式(1)計算：

(1)

1.9 ABTS自由基抗氧化能力測定

八月瓜ABTS自由基抗氧化能力測定方法參照文獻并稍作修改。ABTS自由基工作液配制：取7 mmol/L ABTS 5 mL加入 88 μL 40 mmol/L 的過硫化鉀溶液，混勻后，室溫避光放置12～16 h，形成ABTS自由基儲備液。使用時用乙醇稀釋，于734 nm處測定吸光值，工作液的吸光值應為(0.7±0.02)。樣品前處理同 DPPH 相同，0.3 mL樣品，加入ABTS工作液2.7 mL：對照組為 0.3 mL甲醇和 ABTS工作液2.7 mL，混勻。在多功能酶標板上于734 nm處測定吸光值。樣品組和對照組均設立空白對照。選用VC做標準品對照試驗，按照樣品提取物的實驗方法進行試驗。

1.10 α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定

α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定方法參照張麗等[19]的方法。八月瓜提取物對α-糖苷酶的活性抑制能力采用公式(2)計算，并用Origin軟件求出IC50值。

(2)

1.11 數據統計分析

實驗所有數據以平均值±標準誤差表示，每組實驗進行3次平行。采用Tukey單因素方差分析(P<0.05)，均用Origin 8.5進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 八月瓜提取物組分質譜定性分析

采用高分辨液相質譜聯用技術對八月瓜果皮和種籽提取物的組分進行定性分析。從圖1可看出，八月瓜果皮和種籽提取物的成分相似，出峰時間大致相同，但果皮提取物的峰高和峰面積總體低于種籽提取物，說明種籽的功能性成分高于果皮。表1列出了八月瓜果皮和種籽提取物的主要活性成分，其中酚類物質有綠原酸和2,2’-亞甲基雙-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)，皂苷類物質有斛皮素-3-葡萄糖苷、羽扇豆異黃酮-O-葡萄糖苷、常春藤皂苷D、甾體皂苷F、常春藤皂苷C、常春藤皂甙元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖甙。從峰面積比可看出，這些組分中斛皮素-3-葡萄糖苷在果皮中含量較高，而甾體皂苷F、常春藤皂苷C、2,2’-亞甲基雙-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)在種籽中含量更高，其余成分在果皮和種籽中含量無顯著差異。

2.2 八月瓜提取物總酚、總黃酮、總皂苷含量

八月瓜果皮和種籽提取物中總酚、黃酮、總皂苷含量如表2所示。

注：序號按出峰時間排列，與圖1中標注序號對應。

注：結果是以原料(果皮或種籽)干重計，并且數值均帶有SD值。表中同一列不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

實驗結果表明，八月瓜的總酚、總黃酮、總皂苷含量豐富。潘冬梅等[13]對8種藥食同源原料的總酚和總黃酮含量進行了研究，發現酚含量較高的為甘草、決明子、菊花(>20 mg/g)，較低的為梔子、羅漢果、酸棗仁、郁李仁、萊菔子；總黃酮含量較高的為決明子、菊花、梔子(>24 mg/g)，較低的為甘草、酸棗仁、郁李仁、羅漢果、萊菔子。與此相比，本實驗八月瓜中的總酚、總黃酮含量均顯著高于其他藥食同源植物。查閱部分文獻[14]中關于八月瓜的研究結果，云頂地區的八月瓜總黃酮含量為3.81%，大定地區的含量為2.16%。云霧、都勻、王司等地區分別為2.05%、1.89%、2.86%。發現本實驗所測得的總酚、總黃酮含量都更高，可能是由于地區和季節性差異。八月瓜的總皂苷含量豐富，朱金段等[24]對預知子常春藤皂苷元的含量測量中得出，預知子中常春藤皂苷元的含量在0.10～28.53 mg/g，與本研究所測的總皂苷含量對比可知，八月瓜總皂苷中常春藤皂苷含量較高。從表2中還可看出，八月瓜的種籽中的總酚、總黃酮、總皂苷含量均顯著高于果皮，尤其是總酚含量，八月瓜種籽的總酚含量比果皮含量高出約50 mg/g。

2.3 八月瓜提取物DPPH自由基消除能力

八月瓜提取物的DPPH抗氧化活性如圖2所示。2種提取物都具有清除DPPH自由基的能力，且2種提取物對DPPH自由基的清除能力與其濃度存在明顯的劑量-效應關系。根據潘冬梅等[13]對8種藥食同源原料的DPPH抗氧化活性的研究發現，在10 mg/mL質量濃度下，甘草、決明子的DPPH自由基的清除率低于80%，羅漢果、萊菔子、酸棗仁、郁李仁等的DPPH自由基的清除率低于50%。而八月瓜果皮提取物DPPH自由基清除能力的IC50值為53.56 μg/mL，種籽提取物的IC50值為47.24 μg/mL。對比可以看出，八月瓜的DPPH自由基的清除能力顯著高于其他藥食同源植物。在不同濃度下，八月瓜種籽提取物的DPPH自由基的清除能力均顯著大于果皮提取物。DPPH自由基清除能力可能與總酚、總黃酮含量有關[17]，由此推測，八月瓜種籽提取物表現出較高的清除DPPH自由基的能力主要是因為其總酚和總黃酮含量較高。

2.4 八月瓜提取物ABTS自由基清除能力

圖3為八月瓜提取物ABTS自由基清除能力。從圖3中可以看出，2種提取物均具有清除ABTS自由基的能力，并且可以明顯觀察到隨著提取物濃度的增加，其對ABTS自由基的清除能力逐漸增強，說明2種提取物的濃度對ABTS自由基的清除能力存在明顯的劑量-效應關系。白海娜等人[25]研究白藜蘆醇與黑木耳多糖對ABTS自由基清除的協同作用，得到白藜蘆醇和黑木耳多糖的IC50值分別為3.56和61.46 mg/L。李培源等[26]對雞眼草、白藜蘆醇與黑木耳多糖等對ABTS自由基的清除能力的研究發現雞眼草提取物在0.5 mg/mL時，ABTS自由基清除率最高的為雞眼草乙酸乙酯提取物，清除率為77.5%。八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值為42.25 μg/mL，種籽提取物的IC50值為48.99 μg/mL，與文獻[25-26]結果對比發現，本文中八月瓜提取物對ABTS自由基的清除能力與黑木耳多糖相近，遠高于雞眼草和白藜蘆醇，說明八月瓜提取物抗氧化能力顯著。由圖1和表1可看出，八月瓜提取物中富含綠原酸，八月瓜提取物的ABTS自由基抗氧化活性可能與其綠原酸含量有關系，使其具有較高的ABTS自由基抗氧化活性[27]。另外，八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值為42.25 μg/mL，種籽提取物的IC50值為48.99 μg/mL，可以看出，八月瓜種籽提取物的ABTS自由基清除能力顯著高于果皮提取物。

2.5 八月瓜提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

從圖4可以看出，八月瓜果皮提取物和種籽提取物都具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制能力具有劑量效應。與果皮提取物相比，八月瓜種籽提取物的抑制效果更高。

高小平等[28]對126種經水煮醇沉提取的常用中藥進行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選研究，其研究結果表明，在0.28 mg/mL反應體系下，24種中藥提取物顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中大黃、山茱萸、青果、地瑜、桑白皮等中藥提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率超過90%，虎杖、丹參、知母等中藥提取物抑制率在50%左右，而八月瓜果皮提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值為14.15 μg/mL，種籽提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值為15.54 μg/mL，說明八月瓜具有非常顯著的α-葡萄糖苷酶抑制能力。由于α-葡萄糖苷酶活性與糖尿病的發生密切相關，本實驗結果可以從側面反映八月瓜提取物可能對抑制或減緩糖尿病及其并發癥的出現具有積極的作用。

3 結論

本實驗研究了八月瓜果皮和種籽的化合物組成、總酚、總黃酮、總皂苷含量、抗氧化活性以及糖苷酶活性抑制能力。八月瓜果皮和種籽提取物中檢出9種化合物，多種為甾體皂苷和常春藤皂苷類化合物。八月瓜中富含多酚、黃酮和皂苷類物質，而且種籽中的含量高于果皮。另外，八月瓜種籽提取物和果皮提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力都比較突出，且具有明顯的劑量效應，說明八月瓜具有良好的抗氧化活性。同時，本研究還測得其對α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果良好，且八月瓜種籽提取物的抑制效果顯著優于果皮提取物。本實驗結果為八月瓜相關功能性產品開發提供了研究基礎。在此基礎上，可以進一步探究八月瓜具體活性成分對糖尿病及其并發癥抑制效果機制研究。