糖基化及酶解對大豆蛋白功能性質(zhì)的影響

楊嘉琪，宋春麗

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)的蛋白質(zhì)含量可達90%以上，具有良好的營養(yǎng)價值和功能性質(zhì)，是重要的植物蛋白質(zhì)來源。當前，大豆分離蛋白作為功能性配料在食品加工中的應用越來越廣泛[1]，這迫切需要開發(fā)具有某些更加突出功能性質(zhì)的大豆蛋白產(chǎn)品。

蛋白質(zhì)改性技術(shù)是提高大豆分離蛋白功能性質(zhì)的必要手段。蛋白質(zhì)改性方法很多[2]，糖基化修飾和酶法水解是特別有前景的技術(shù)手段[3-4]。蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)依賴于其相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和氨基酸組成等[5]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化修飾是一種新型的糖基化修飾手段[6]。該酶不僅可以使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生共價交聯(lián)反應，而且能夠催化酰基轉(zhuǎn)移反應，將氨基糖導入蛋白質(zhì)側(cè)鏈分子中，致使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。而酶法水解是在特定pH和溫度的條件下，催化大分子蛋白質(zhì)的肽鏈斷裂，產(chǎn)生肽甚至是氨基酸[7]。這個過程極大地改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成。理論上，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化修飾和酶解都會改變蛋白質(zhì)的功能特性。一些研究結(jié)果也表明[8]，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶途徑的糖基化修飾改善了大豆分離蛋白的乳化性。而酶解改善了葵花分離蛋白的乳化穩(wěn)定性[9]以及大豆分離蛋白的溶解性[10]。一般來說，單一的改性處理效率相對較低，結(jié)合不同的修飾方法處理蛋白質(zhì)能夠提高蛋白質(zhì)的功能特性[11]。但轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶途徑的糖基化和酶解相結(jié)合改造大豆蛋白的功能性質(zhì)，尚未見有關(guān)的研究報告。

本研究首先利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶途徑制備糖基化大豆蛋白，隨后利用堿性蛋白酶(Alcalase)酶解制備其水解產(chǎn)物，評估糖基化大豆蛋白的酶解產(chǎn)物的性質(zhì)變化，包括熱特性及功能性質(zhì)(溶解性，持水、持油性和乳化性)，揭示糖基化和酶解相結(jié)合對大豆蛋白性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

脫脂豆粉，哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，江蘇一鳴精細化工有限公司；殼寡糖(平均分子量為1 kDa，脫乙酰度≥90%)，浙江金殼生物化學有限公司；堿性蛋白酶(2.94×102U/mg)，諾維信公司；大豆油，九三糧油工業(yè)集團有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

XW-80A型渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠；T25型均質(zhì)機，德國IKA公司；UV5100型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TDZ5-WS型高速離心機，浙江湘儀有限公司；STA 449 F3 Jupiter型熱分析儀，德國Netzsch公司；Nano-ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀，英國Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化大豆蛋白酶解產(chǎn)物的制備

按照文獻[4]的方法制備糖基化大豆蛋白(glycosylation soyoean protein isolate,GSPI)，隨后以Alcalase為水解用酶，根據(jù)pH-Stat法，控制添加的NaOH體積，制得水解度(degree of nydrolysis,DH)分別為1%、2%和4%的酶解產(chǎn)物。具體方法為：配制蛋白質(zhì)分散液20 g/L，pH 8.5，溫度保持60 ℃，按E/S為1‰(w/w)的比例加入Alcalase，反應過程中通過滴加NaOH溶液維持反應體系的pH為8.5。酶解反應結(jié)束后，立刻取出反應產(chǎn)物在85 ℃水浴鍋中滅酶5 min，隨后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH為7.5，冷凍干燥，所得修飾產(chǎn)物進行功能性的測定。

1.2.2 熱特性分析

使用STA-449F3型熱重分析儀進行熱特性分析。待測樣品首先在飽和的食鹽水環(huán)境中(相對濕度約為75.5%)室溫放置24 h。隨后取5 mg樣品放入氧化鋁坩堝中，氮氣流量為50 mL/min，并且以10 ℃/min的速率在25～140 ℃的溫度條件下測定。

1.2.3 溶解性的測定

配制pH 2～11的緩沖液溶解蛋白質(zhì)樣品，樣品質(zhì)量濃度為2 g/L。旋渦30 s后置于4 ℃冰箱過夜，使其充分溶解。次日8 000 g/min離心20 min，收集上清液測定其蛋白質(zhì)含量。溶解性以蛋白質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)含量所占的比例表示[12]。其中，緩沖液的配制方法為：pH 2～3，0.05 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液；pH 4～5，0.05 mol/L的乙酸鹽緩沖液；pH 6～8，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液；pH 9～11，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液。

1.2.4 持水性和持油性的測定

參照文獻[13]的方法測定蛋白質(zhì)的持水性及持油性。稱取0.1 g蛋白質(zhì)于干燥的離心管中(總質(zhì)量為W1)，隨后向離心管中加入4 mL蒸餾水，旋渦，至離心管內(nèi)蛋白質(zhì)與水充分混合，室溫下靜置30 min，5 000g離心30 min，緩慢倒出上清液，稱量離心后離心管的質(zhì)量(W2)，持水性按公式(1)計算。

(1)

式中：W0，加入蛋白質(zhì)干重,g；W1，離心管與干燥的蛋白質(zhì)質(zhì)量之和,g；W2，離心后離心管的質(zhì)量,g。

準確稱量0.1 g蛋白質(zhì)于離心管中，隨后加入4 mL(V1)精制大豆油，旋渦使樣品與植物油充分接觸，室溫放置30 min后5 000 g/min離心30 min，隨后將上清液移出記錄其體積為V2。見公式(2)。

(2)

式中：W0，加入蛋白質(zhì)干重,g；V1，加入油的體積，即4 mL；V2，上清液的體積,mL。

1.2.5 乳化性的測定

1.2.5.1 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

用0.1 mol/L(pH 7.5)的磷酸鹽緩沖液溶解待測蛋白質(zhì)樣品，配制1 g/L的蛋白質(zhì)分散液，從中取75 mL并與25 mL大豆油混合，12 000 r/min均質(zhì)1 min，靜置10 min。分別在0 min和10 min時從底部取50 μL乳液加入到5 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的SDS溶液中，混勻，在500 nm處測定吸光值[14]。乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計算方法見公式(3)和(4)。

(3)

(4)

式中：T=2.303；A0，零時刻的吸光度值；ρ，乳化前蛋白質(zhì)樣品溶液的質(zhì)量濃度,g/mL；φ，溶液中油的體積分數(shù)；A10，乳液靜置10 min后的吸光度。

1.2.5.2 乳液的平均粒徑和電位的測定

配制1 g/L的蛋白質(zhì)分散液，與大豆油以體積比1∶3混合，于12 000 r/min均質(zhì)1 min，4 ℃放置20 h后，稀釋至0.1 mg/mL。隨后用Nano-ZS90型粒度分析儀測定乳液的粒徑和電位[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱特性

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和功能性質(zhì)的重要指標。本研究分析了大豆分離蛋白及其修飾產(chǎn)物的差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，在20～140 ℃范圍內(nèi)，所有的測試樣品都是吸熱反應，對應的SPI、GSPI、GSPI-1%DH、GSPI-2%DH、GSPI-4%DH五種蛋白質(zhì)熱變性溫度分別為74.6、66.1、65.2、62.5、75.1 ℃。樣品的熱穩(wěn)定性和熱變性溫度呈正相關(guān)，可見經(jīng)過糖基化修飾的大豆蛋白熱穩(wěn)定性下降，這與FU等[16]的研究結(jié)果一致。而糖基化大豆蛋白經(jīng)過Alcalase酶解后得到的產(chǎn)物(水解度為1%～4%)的熱穩(wěn)定性先下降后增加。焓變ΔH和蛋白質(zhì)的有序程度有關(guān)[17]。相比于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的ΔH顯著增高，可能是由于糖基化修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更緊密，而水解產(chǎn)物的ΔH隨著水解度的增大而減小，原因可能是酶解使蛋白質(zhì)形成小分子肽，降低了蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)。

2.2 溶解性

不同pH條件下的大豆蛋白及其修飾產(chǎn)物的溶解性如圖2所示。

從圖2可以看出，在pH值2～11范圍內(nèi)，大豆分離蛋白的糖基化產(chǎn)物的溶解性下降。雖然糖基的導入有利于提高蛋白質(zhì)的溶解性[18]，但是在糖基化修飾過程中蛋白質(zhì)分子內(nèi)/間的交聯(lián)反應與糖基的導入共同發(fā)生，交聯(lián)修飾導致大豆蛋白聚集生成大分子聚合物[19]。相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的酶解產(chǎn)物的溶解性顯著提高，并且隨著水解度的增大而增大。在等電點(pH 4.5)處，水解度為4%的糖基化大豆分離蛋白(GSPI-4%DH)溶解性提高了54.0%，在中性pH 7.0處的溶解性提高了43.9%。酶解使蛋白質(zhì)釋放小分子肽，從而提高了蛋白質(zhì)的柔韌性[11]。ZHANG等[20]的實驗結(jié)果表明，限制性酶解提高了大豆分離蛋白-麥芽糊精交聯(lián)產(chǎn)物的溶解性。結(jié)果表明，糖基化修飾降低了大豆蛋白的溶解性，而隨后的限制性酶解顯著地提高了蛋白質(zhì)的溶解性，這有利于擴大大豆蛋白在酸性及中性食品的應用。

2.3 持水性和持油性

蛋白質(zhì)的持水性和持油性在食品加工和保藏過程中十分重要。大豆分離蛋白及修飾產(chǎn)物的持水性和持油性的結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，相對于大豆分離蛋白，糖基化產(chǎn)物的持水性提高了11.7%，可能是由于蛋白質(zhì)與糖發(fā)生了共價交聯(lián)反應，而導入的殼寡糖中含親水性糖基，使蛋白質(zhì)的持水能力增加。而水解產(chǎn)物的持水性隨著水解度的增大逐漸變小，分別降低了86.7%、88.3%和97.1%。原因可能是蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后肽鍵斷裂，形成小分子肽，不利于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，從而持水性下降[21]。此外可以看出，相比于大豆分離蛋白，改性后蛋白質(zhì)的持油性顯著增強。糖基化和水解使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露，有利于提高產(chǎn)物的持油能力[22]。

2.4 乳化性

2.4.1 乳化活性及乳化穩(wěn)定性

大豆分離蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，糖基化大豆蛋白的乳化活性最低，但是具有較高的乳化穩(wěn)定性。經(jīng)Alcalase酶解后，產(chǎn)物的乳化活性提高，水解度為2%和4%的糖基化產(chǎn)物的乳化活性顯著提高(高于大豆蛋白)，但是乳化穩(wěn)定性下降，此時的乳化穩(wěn)定性為大豆蛋白的79.6%和76.3%。水解物中肽的相對分子質(zhì)量降低，在界面處不能穩(wěn)定吸附，所以乳液發(fā)生聚集，乳化穩(wěn)定性下降[23]。

2.4.2 乳液的平均粒徑電位

乳液的平均粒徑、電位與蛋白質(zhì)的乳化活性直接相關(guān)[24]，分析乳液的平均粒徑和電位對深入剖析蛋白質(zhì)的乳化性有一定的意義。乳化平均粒徑和電位分析結(jié)果見圖5。

相比于大豆蛋白(130.9 nm)，糖基化修飾產(chǎn)物的乳液平均粒徑最大(153.5 nm)，而其酶解產(chǎn)物的乳液平均粒徑減小(1%～4%DH 的GSPI分別為150.7、135.2、116.5 nm)，而且隨著水解度的增大逐漸減小(圖5)。這是因為酶解后的蛋白質(zhì)疏水基團暴露，隨著疏水基團的增加，在均質(zhì)過程中，蛋白質(zhì)能更快吸附到油水界面，將油滴包裹起來，阻止液滴聚集，因而使乳液的平均粒徑變小。酶解后蛋白質(zhì)的分子體積變小也是其中一個原因。HEMAR等[25]研究發(fā)現(xiàn)，乳液的平均粒徑和乳化活性呈負相關(guān)，即乳液平均粒徑越小，乳化活性越大。這與本實驗的研究結(jié)果一致。

除此之外，電位的變化也一定程度上與乳液的穩(wěn)定性相關(guān)。本研究分析的電位絕對值變化為：糖基化大豆蛋白>大豆蛋白>糖基化大豆蛋白水解物(GSPI-4%DH 除外)。高電位值表明液滴間的斥力大，乳液的穩(wěn)定性增強[26]。因而GSPI具有較高的乳化穩(wěn)定性，而水解物表現(xiàn)為較低的乳化穩(wěn)定性，這與比濁法分析結(jié)果一致(圖4)；但是，以其水解物制備的乳液電位先下降后增加(1%～4%DH 的GSPI分別為-22.9、-15.3、-29.9 mV)，這與乳化穩(wěn)定性的分析結(jié)果不一致。而GSPI-4%DH雖然具有較高的電位，但是其乳化平均粒徑下降，在界面處不能穩(wěn)定吸附，所以乳液發(fā)生聚集，乳化穩(wěn)定性下降[24]。

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶途徑的糖基化及隨后的酶解修飾相結(jié)合能夠改變大豆分離蛋白的功能性質(zhì)。糖基化大豆蛋白在低水解度(1%～4%)時，就能夠顯著地改善糖基化大豆蛋白的一些功能性質(zhì)。在水解度為4%時，溶解性增加(等電點pH 4.5和中性pH 7.0條件下分別提高了54.0%和43.9%)；乳化活性和持油性分別增加了19.5%和35.4%。因而結(jié)合糖基化和酶解修飾，能夠制備出具有理想功能性質(zhì)的食品功能性配料。