云南腐乳發酵菌種的分離鑒定及其低鹽腐乳的品質分析

楊智慧，張軍偉，魏冠棉，周鵬*

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫,214122)

腐乳(sufu)是以大豆為主要原料，經加工磨漿、制坯、培菌、發酵而制成的調味、佐餐制品[1]。云南牟定腐乳深受云貴川等地區消費者喜愛，然而其生產仍沿用傳統工藝，開放的自然條件下微生物種類十分復雜，使腐乳終產品質量極不穩定。

食鹽在腐乳的生產中主要具有以下作用：提供咸味；與谷氨酸結合，使腐乳產生鮮味；降低水分含量，增加鹽坯硬度；抑制和防止雜菌污染；抑制發酵過程中酶的活性，使其不至過度分解[2]。腐乳中鹽含量過低會導致腐乳質地松散或腐敗變質，引發食品安全問題[3]；而鹽含量過高則會使產品生產周期變長[4]，增加消費者患病風險，使產品的消費受限制[5]。本文分離純化了云南自然發酵腐乳中的霉菌，并用于制備低鹽腐乳，同時分析其理化性質、微觀結構、揮發性風味物質及感官特性，以期為低鹽腐乳的實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

大豆，購自安徽省；菜籽油、辣椒、花椒、食用鹽，購自云南當地；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)，北京陸橋技術股份有限公司；2-苯基乙酸乙酯(色譜純)，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

YJ-VS-1單人垂直超凈工作臺，無錫一凈凈化設備有限公司；G154DWS立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；SHP-15生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；DM2000生物顯微鏡，徠卡顯微系統有限公司；C1000 TouchTM基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；Agilent 1100氨基酸分析儀，美國安捷倫科技有限公司；S220 Seven Compact pH計，梅特勒-托利多公司；X08A自動硝化裝置，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；K1302自動定氮分析儀，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Trace 1300 GC-MS色譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐乳發酵菌種的分離純化

從腐乳廠隨機采集自然發酵3 d后的毛坯，將毛坯分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七個梯度稀釋，每個梯度取100 μL涂布到PDA平板中，28 ℃培養觀察。

取平板上單個菌落，以點接法接種在PDA平板上，28 ℃培養觀察，直至菌落形態穩定且單一。用生物顯微鏡對分離菌株的形態進行觀察。

1.2.2 低鹽腐乳的制備

腐乳的制備工藝參考地標DB53/T 713—2015[6]，大豆經浸泡后磨漿、煮漿、點漿、壓榨成坯，然后切成小塊，制得豆腐；在豆腐上均勻地噴灑霉菌孢子懸浮液，培養3 d，制得毛坯；將毛坯進行晾曬、鹽漬(10 kg毛坯中含500 g鹽)，得到鹽坯；鹽坯與辣椒、花椒、姜片、不同比例的鹽(10 kg鹽坯中分別含1 000、700、400 g鹽，分別相對于傳統牟定腐乳100%、70%和40%的鹽添加量)混勻后裝瓶，加入湯汁(含體積分數為3%乙醇)后發酵90 d制得低鹽腐乳。

1.2.3 低鹽腐乳理化指標的測定

水分含量[7]：按照國家標準GB 5009.3—2016中規定的“直接干燥法”進行檢測。

NaCl含量[8]：按照國家標準GB 5009.44—2016中規定的“佛爾哈德法(間接沉淀滴定法)”進行檢測；

總酸含量[9]：按照國家標準GB/T 12456—2008中規定的“酸堿滴定法”進行檢測；

氨基酸態氮含量[10]：按照國家標準GB/T 5009.235—2016中規定的“酸度計法”進行檢測；

水溶性蛋白含量[11]：按照農業部推薦標準NY/T 1205—2006進行檢測；

粗蛋白含量[12]：按照國家標準GB 5009.5—2016中規定的“凱式定氮法”進行檢測；

蛋白質水解程度：以氨基酸態氮(amini acid nitrogen,AAN)/總氮(total nitrogen,TN)結合水溶性蛋白(water-soluble protein,WP)/粗蛋白(crude protein,CP)的百分比表示蛋白的水解程度。

1.2.4 菌種的鑒定

所分離菌株的全基因利用CTAB法提取。PCR擴增引物采用真菌通用引物NS1:5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS8:5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’。PCR反應體系見表1，PCR反應采用TaqPCR Master Mix試劑盒。PCR的循環步驟：94 ℃預變性4 min，34次循環，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測序。

根據其所測的序列在NCBI網站中進行比對，找出與所測序列最相似的菌株，并采用Mega 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 低鹽腐乳游離氨基酸含量的測定

采用氨基酸分析儀進行測定，具體方法參考文獻[13]。

1.2.6 低鹽腐乳微觀結構的觀察

采用掃描電子顯微鏡對低鹽腐乳微觀結構進行觀察，具體方法參考文獻[14]。

1.2.7 低鹽腐乳揮發性風味物質的測定

樣品前處理：將5 g腐乳、1 g NaCl和5 g H2O充分混勻后，取5 g混合物于頂空瓶中，上機分析前加入20 μL 2-苯基乙酸乙酯甲醇溶液作為內標物(內標物質量濃度為320.5 μg/mL)。

采用色譜儀進行測定，具體方法參考文獻[15]。

1.2.8 低鹽腐乳的感官評價

低鹽腐乳的感官評價參考地方標準DB53/T 713—2015[6]、沈子林[16]、張曉鳴等[17]的方法，并結合實際樣品進行了一定修改：10名感評人員(5男5女)分別按照表2對腐乳的色澤、香氣、質地、滋味進行評分，按照表3對腐乳進行接受度檢驗。

1.2.9 數據分析

實驗數據用SPSS 23.0軟件進行分析，結果以“平均值±標準差”表示，以P<0.05作為差異具有統計學意義的判斷標準；用SPSS 23.0軟件對鹽含量和理化指標數據進行皮爾遜相關性(Pearson correlation,PC)分析。

2 結果與分析

2.1 菌種的形態學觀察

經分離純化后獲得了純種菌株M2，其形態學觀察結果如圖1所示。M2菌落中心為淺黃色，邊緣為白色，呈薄棉絮狀，菌絲茂密，有分生孢子和孢子囊，孢子囊頂生，內含大量孢囊孢子，孢囊梗不分支，根據《真菌學》[18]初步判斷為毛霉屬真菌。

2.2 分子生物學鑒定

通過NCBI對菌株M2的基因測序結果進行Blast比對分析，結果顯示M2與總狀毛霉(Mucorracemosus)同源性最高。利用Mega 7.0軟件構建菌株M2與毛霉屬部分模式種的基因序列系統發育樹如圖2所示，菌株M2與Mucorracemosus(JF723681.2)處同一進化分支，親緣關系最近。

綜合對菌種的形態學觀察結果以及基因序列的系統發育分析結果，將菌株M2初步鑒定為總狀毛霉，并保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CGMCC No.15264。

2.3 低鹽腐乳理化性質分析

低鹽腐乳中的鹽含量、總酸、氨基酸態氮、水溶性蛋白及粗蛋白含量結果見表4。相對于傳統云南牟定腐乳100%、70%和40%(質量分數)鹽添加量制備的腐乳(M2-100%、M2-70%和M2-40%)，鹽含量分別為8.15、6.83和5.03 g/100 g；水分含量均為69%左右；腐乳的總酸隨著鹽含量的降低而升高，主要是由于降低鹽含量使得其對酶的抑制作用減小，腐乳蛋白水解程度增大造成的；從AAN/TN和WP/CP的結果可看出，腐乳的蛋白水解程度隨著鹽含量的降低而增大，這與氨基酸態氮和水溶性蛋白的變化趨勢相一致。M2-100%、M2-70%和M2-40%理化指標的檢測結果均符合云南省地方標準DB53/T 713—2015《地理標志產品 牟定腐乳》[6]中腐乳成熟的理化要求。

注：同一列中標記有不同字母(a，b，c)的數據間有顯著性差異(P<0.05);TN=CP/5.71表示總氮含量

采用SPSS 23.0對各理化指標與鹽含量進行皮爾遜相關性分析，結果如表5所示。腐乳中的鹽含量與總酸、水溶性蛋白含量呈較顯著的負相關，與氨基酸態氮含量、蛋白質水解程度呈顯著的負相關，這與文獻報道[4]的相似。

注：**表示在0.01水平(雙側)上顯著相關；*表示在0.05水平(雙側)上顯著相關

2.4 低鹽腐乳游離氨基酸含量分析

低鹽腐乳中的游離氨基酸含量結果見表6。M2-100%、M2-70%和M2-40%的總氨基酸含量分別為22.62、26.98、30.59 g/100 g。腐乳中含量最高的游離氨基酸為呈鮮味的谷氨酸，其次為天冬氨酸，隨著鹽含量的降低，游離氨基酸含量逐漸升高，這與HAN等[19]的研究結果相一致，且與腐乳理化性質的變化趨勢相一致。

注：“-”表示未檢測出

2.5 低鹽腐乳微觀結構分析

采用掃描電鏡對低鹽腐乳微觀結構的觀察結果如圖3所示。

隨著鹽含量的降低，凝膠結構的孔徑逐漸縮小，且更加致密均一。M2-100%內部呈網絡結構，存在較多的大孔徑，可能是因為蛋白質的水解程度較低，蛋白質膠粒較大，蛋白凝膠結構受到的破壞程度有限；M2-70%的微觀結構與M2-100%相似，但M2-70%的凝膠孔徑略小；M2-40%的孔徑最小，致密均一，說明其蛋白質水解程度最高，這與汪建明等[20]、張媛媛等[21]的結果相一致。

2.6 低鹽腐乳的揮發性風味物質分析

低鹽腐乳中的揮發性風味物質結果見表7。M2-100%、M2-70%、M2-40%中均檢測出了45種揮發性物質，包括15種酯類、12種醇類、5種酸類、4種醛類、4種烯類、2種酮類和3種雜環類物質。3種鹽含量的腐乳揮發性物質種類相近，但含量具有顯著的差異。M2-100%、M2-70%、M2-40%中揮發性風味化合物含量分別為17 964.42、29 090.05、19 644.56 μg/kg，其中酯類、醇類、烯類含量所占比例較大。腐乳中揮發性風味物質可由蛋白質及脂肪酸等大分子物質的分解代謝及其他酶催化反應(尤其是酯化反應)途徑產生；由于不同含量的鹽對酶類的抑制作用不同，故含不同鹽含量的腐乳中揮發性物質含量不同。

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

酯類大多具有特殊香氣，可賦予腐乳香甜氣味。其中辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸-2-苯乙酯、苯乙酸乙酯賦予了腐乳果香、奶香和花香[22]，苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯賦予了腐乳冬青油香，十四酸乙酯、丙位壬內酯賦予了腐乳椰子香。腐乳的揮發性風味物質中，乙酯類物質含量較高，可能是腐乳中脂質水解產生的脂肪酸與所加入的乙醇發生酯化反應生成的；另外，LI等[23]認為酯類的增加主要發生在加入酒精的腌制期，且產生的酯類含量與加入的酒精含量呈正相關。

醇類具有較強烈的香味，腐乳中醇的種類和含量與外界添加有關，腌制時由于添加乙醇，腐乳中醇的種類和含量增加，且醇能與脂肪酸等酸類物質通過酯化反應生成酯類物質。此外，香辛料的加入也大大豐富了腐乳醇類成分，花椒中含有大量的香氣成分，其中主要含有芳樟醇、4-萜烯醇、松油醇等[24-25]，因此腐乳中含量最為豐富的芳樟醇、4-萜烯醇和松油醇等，可能來自于配料中的花椒。

腐乳中另一大類揮發性物質是醛類，醛類物質中苯甲醛含量最高，可由游離的苯丙氨酸轉化而來[26]，能夠賦予腐乳苦杏仁香味。

2.7 低鹽腐乳的感官評價

低鹽腐乳的感官評定結果如圖4所示。M2-100%、M2-70%、M2-40%的色澤和香氣無顯著性差異，且得分均在7～9分之間，符合腐乳的要求[15]。M2-100%滋味得分為7.20分，M2-70%(8.28分)和M2-40%(7.90分)的滋味得分均高于M2-100%；且M2-70%(8.10分)和M2-40%(7.74分)的質地得分也高于M2-100%(7.00分)。結合低鹽腐乳的理化性質來看，可能是由于M2-70%和M2-40%的水解程度比M2-100%高，所以呈味的小分子含量更高，滋味更好，且質地更細膩軟糯；而M2-40%的滋味和質地得分相對于M2-70%較低，則可能是M2-40%過度水解導致質地過軟，且鹽含量過低，滋味相對寡淡。低鹽腐乳的喜好度得分順序為M2-70%>M2-40%>M2-100%，這與滋味和質地的感評結果相一致。

3 結論

通過對分離純化菌種的形態學觀察和分子生物學鑒定，所分離出來的菌種為總狀毛霉。將該菌種應用于低鹽腐乳的制備，確定降低鹽含量可提高蛋白質的水解程度和游離氨基酸含量，使得微觀結構更加致密均一；低鹽腐乳中共檢測出了45種揮發性風味物質，酯類、醇類和烯類含量所占比例較大，且鹽含量對揮發性風味物質含量有較大影響；M2-100%、M2-70%、M2-40%腐乳接受度皆較好，但M2-70%的接受度最高。這為M2的實際應用、傳統腐乳發酵工藝的改進及低鹽腐乳的開放提供了理論指導。