黑曲霉Aspergillus niger NCUF413.1對特香型白酒釀造出酒率和風味的影響

潘菲，董彪，劉婷，陳妍，陳可丹，黃冰靜，萬茵，劉成梅，張鵬，付桂明*

1(食品學院食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)2 (江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司，江西 樟樹，331200)

中國白酒是采用典型的同步糖化發(fā)酵的固態(tài)釀造方式生產(chǎn)，霉菌的糖化作用與淀粉原料的轉(zhuǎn)化息息相關。固態(tài)發(fā)酵對原料的利用率低，淀粉質(zhì)原料的糖化發(fā)酵不完全，是造成白酒固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酒率較低的重要原因。大曲是白酒釀造過程中微生物主要來源之一[1]，其含有的大量霉菌能夠分泌多種淀粉酶、糖化酶等水解酶類[2]。這些酶能將淀粉水解成小分子糖，為酵母菌乙醇發(fā)酵及香氣物質(zhì)的生成提供能量和小分子物質(zhì)[3]，直接影響白酒出酒率和重要香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，對整個釀造過程產(chǎn)酒精和呈香有重要貢獻。米曲霉、河內(nèi)白曲霉、黑曲霉和米根霉等霉菌是白酒生產(chǎn)中常用的霉菌，具有較高的糖化力[4-5]，同時其具有耐酸特性且能分泌較多酸性蛋白酶，能夠提高出酒率，已被廣泛應用于白酒釀造。

本文對特香型白酒大曲中的霉菌進行分離純化，篩選鑒定高產(chǎn)糖化酶霉菌，將其與釀酒酵母共同制備成麩曲強化大曲，接種于酒醅，按特香型白酒釀造工藝進行強化釀造，分析高糖化力霉菌對提高白酒固態(tài)發(fā)酵出酒率和原酒中風味物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特香型中溫大曲、大米、稻殼，江西樟樹貢酒廠有限公司。土豆、麩皮等，市購；淀粉、酵母膏、NaCl、NaOH、(NH4)2SO4、I2、KI、醋酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、Na2SO3、酒石酸鉀鈉等(國產(chǎn)分析純)；乳酸石炭酸棉藍染液,廈門海標科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、Taq酶,天根生化科技(北京)有限公司；葡萄糖(BR純度),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉(AR純度),北京索萊寶科技有限公司；DNA Marker,寶日醫(yī)生物技術有限公司；4-甲基-2-戊醇,德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 培養(yǎng)基和菌種

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖和瓊脂，加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

糖化力初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉12 g，酵母膏8 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水1 000 mL。

麩皮培養(yǎng)基：新鮮麩皮10 g，加水15 mL，裝于250 mL三角瓶中，0.12 MPa高壓滅菌40 min，重復進行2次滅菌。

SaccharomycescerevisiaeNCUF303.1 為本實驗保存的高產(chǎn)酒精釀酒酵母。

1.3 儀器與設備

ZDX-35BI型坐式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；7890-7000 GC-QQQ-MS，美國Agilent公司；57330-U SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷 固相微萃取纖維頭，美國Supelco公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 特香型白酒大曲中霉菌的分離純化[6]

將5 g大曲粉置于含有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)2～3 d，將選中的菌落進行傳代培養(yǎng)，并通過反復劃線進行純化。

1.4.2 特香型白酒大曲中高糖化霉菌的篩選

將霉菌點種于初篩培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，向培養(yǎng)皿中加入適量顯色劑染色。靜置，測量平板中菌落和透明圈的直徑大小，計算水解圈(hydrolysis cirole,HC)值(HC=透明圈直徑/菌落直徑)，以HC值的大小作為衡量糖化力強弱的標準。

菌株經(jīng)斜面活化后，用血球計數(shù)板計數(shù)后稀釋至孢子數(shù)達107CFU/mL,接種于麩皮培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h，采用DNS試劑法測定糖化酶酶活，采用Young J.Yoo改良法測定α-淀粉酶活[7]。

1.4.3 真菌菌落、生化鑒定

采用插片法對復篩霉菌的菌落形態(tài)進行顯微形態(tài)結構觀察，參照真菌分類鑒定手冊，初步確定菌株分類。

1.4.4 霉菌分子鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取霉菌DNA。以上述提取的霉菌基因組DNA為擴增模板，進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在GenBank上進行比對，鑒定種屬。

1.4.5 麩曲的制備應用分析

取篩選得到的高糖化力霉菌和實驗室保存的1株釀酒酵母，以麩皮培養(yǎng)基制備強化麩曲。根據(jù)酒廠的實際生產(chǎn)工藝，功能麩曲加入量占大曲總量13%，將其與粉碎的大曲一起添加到冷卻的糧醅中，其中曲占酒糟的比例為20%，加入后需充分攪拌均勻。其中實驗A組為霉菌和酵母共同添加，B組和C組分別添加霉菌和酵母，D組為對照組。

將不同實驗組應用于模擬特香型白酒釀造體系中，發(fā)酵周期為30 d，蒸餾得酒樣，并進行分析，釀酒實驗重復3次。

1.4.6 酒樣指標分析

(1)出酒率按照中國釀酒工業(yè)學會定義，按公式(1)計算:

(1)

式中：m,產(chǎn)50%(vol)酒樣質(zhì)量,g;M,大米的質(zhì)量，g。

(2)酒精度按照國標 GB 5009.225—2016測量酒樣的酒精度。

(3)揮發(fā)性成分分析

A.HS-SPME條件。取5 mL酒樣于頂空瓶中，添加10 μL 4-甲基-2-戊醇內(nèi)標溶液，萃取參數(shù)分別為5%酒精度、0.2 g/mL NaCl、萃取溫度50 ℃、萃取時間30 min。萃取結束后，插入氣相進樣口熱解析5 min后拔出，并分析檢測。每個樣品平行3次。

B.GC-MS條件。氣相色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：He；流速1 mL/min；分流比10∶1；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源EI，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍28～500 amu，掃描方式為全掃描。

C.酒樣揮發(fā)性成分RI和含量的測定。定性分析：將正構烷烴標準品液體進樣，按上述酒樣升溫程序進行分離，進樣量為1 μL，分流比為10∶1。根據(jù)每個正構烷烴出峰的保留時間來計算樣品組分峰的保留指數(shù)RI[8]。與質(zhì)譜庫中的化合物進行匹配。定量分析：以內(nèi)標物質(zhì)(4-甲基-2-戊醇)的濃度、峰面積計算各揮發(fā)物的含量,重復測量3次。

2 結果與分析

2.1 糖化霉菌的分離、篩選

從73株霉菌菌株初篩出HC較大的14株霉菌，測定其糖化酶、液化酶酶活，結果如圖1所示。

由圖1可知，菌株NCU-69的糖化酶和液化酶酶活均高于其他菌株，液化酶活力最強為631.96 U/g，糖化酶活力為938.63 U/g，綜合考慮選定其為目標菌株。

2.2 糖化霉菌的鑒定

2.2.1 霉菌的形態(tài)及鑒定

利用插片法對其進行培養(yǎng)，利用乳酸石碳酸棉藍染液對其染色制片，在顯微鏡下觀察的菌株形態(tài)特征如圖2所示。

圖2顯示，從形態(tài)特征上，NCU-69菌落表面為黑褐色、粉末狀，菌落生長快；分生孢子頭的頂囊球形狀為近球形、黑褐色、呈放射狀排列，孢子呈鏈狀、布滿頂囊；分生孢子梗較長，表面光滑、無隔，這些都符合曲霉屬的形態(tài)特征。

2.2.2 菌種的分子生物學鑒定

將獲得的NCU-69菌株的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，結合菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，鑒定NCU-69為黑曲霉(Aspergillusniger)，命名為NCUF413.1。

2.3 糖化霉菌應用性能分析

2.3.1 糖化霉菌酒樣理化指標測定

將不同菌種組合麩曲強化大曲釀造的酒醅進行蒸餾，測酒樣酒精度折算成出酒率，結果如表1所示。

與對照組酒樣比較，A組出酒率由26.21%提高到34.35%。其原因可能是強化的A.nigerNCUF413.1和S.cerevisiaeNCUF303.1協(xié)同作用，強化的黑曲霉分泌糖化酶和液化酶加速了對原料糖化分解，被釀酒酵母利用轉(zhuǎn)化為酒精。B組單獨用A.nigerNCUF413.1強化出酒率比對照組提高0.8%，這是由于A.nigerNCUF413.1水解淀粉成小分子糖還原糖，在白酒釀造過程中，為酒醅中原有釀酒酵母乙醇發(fā)酵提供了還原糖[9]，從而提高了出酒率。而C組單獨用S.cerevisiaeNCUF303.1強化時，出酒率卻下降了，原因可能是強化了釀酒酵母，在釀造前期快速生成乙醇對霉菌的生長有抑制作用[10]，反而降低了淀粉的水解。

2.3.2 功能霉菌強化酒樣香氣成分測定

采用GC-MS對A組和對照組酒樣中的揮發(fā)性成分進行分析，酒醅固相微萃取物質(zhì)質(zhì)譜總離子流色譜圖如圖3所示。

將不同菌種強化酒樣依次測定揮發(fā)性成分，如圖3所示，3種強化酒樣與對照組酒樣總離子流色譜圖基本相似，各酒樣中揮發(fā)性成分峰形一致，說明不同酒樣中香氣成分種類基本一致。

對總離子流圖中的各峰與數(shù)據(jù)庫MPW2011和NIST11標準質(zhì)譜圖庫進行比對，結合保留指數(shù)定性，不同菌種強化酒樣中揮發(fā)性成分的含量結果見表2。

由表2可知，經(jīng)GC-MS從A、B、C和對照組酒樣中分別鑒定出67、66、66和67種揮發(fā)性成分，只有A組黑曲霉和釀酒酵母共強化的酒樣與對照組中揮發(fā)性成分種類完全一致。67種揮發(fā)性成分包括酸類物質(zhì)2種，醇類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)36種，醛酮類物質(zhì)16種，烴類化合物4種等。其中苯乙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醛和3-糠醛的含量較高，其總離子流圖響應值明顯高于其他物質(zhì)。相關的研究表明[37]，特香型白酒中的特征香型物質(zhì)主要為奇數(shù)脂肪酸乙酯等酯類物質(zhì)，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯等，這與本次研究結果相似。

注：n.d表示未檢出或含量較低，RI≥700開始檢測

白酒中酸類、醇類、酯類和醛酮類等眾多微量呈香物質(zhì)是決定白酒風格和質(zhì)量的關鍵因素。其中，酯類化合物是白酒產(chǎn)品中最重要的呈香物質(zhì)之一，也是酒香濃郁的主要物質(zhì)，酯類化合物在總揮發(fā)性物質(zhì)中比例高低對白酒香味濃郁起重要作用。結果表明，A.nigerNCUF413.1強化可提高釀造的酒樣中總酯含量，單獨黑曲霉強化酒樣酯類化合物含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的70.11%，A組黑曲霉和釀酒酵母酒樣中酯類化合物含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的71.01%，均高于對照組的62.94%。A組酒樣中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯香風味物質(zhì)的含量均高于對照組。HUANG Y等[38]從茅臺酒大曲中分離出一株黑曲霉，通過研究該菌蛋白酶對茅臺酒香氣的影響發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)酶能提高酒樣中醇和酯類的含量。

3 結論

從特香型白酒大曲中篩選得到1株高糖化酶力菌株A.nigerNCUF413.1，與S.cerevisiaeNCUF303.1共同制作強化麩曲，按特香型白酒釀造工藝進行強化釀造發(fā)現(xiàn)，出酒率由26.21%提高到34.35%，揮發(fā)性成分種類一致，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯類化合物含量升高，其占總揮發(fā)性成分比例提高了8.07%。產(chǎn)糖化酶霉菌A.nigerNCUF413.1與釀酒酵母共同強化釀造，有助于白酒發(fā)酵中酯類物質(zhì)的產(chǎn)生，提高出酒率，提高白酒酯香風味成分含量。