枯草芽孢桿菌生產β-丙氨酸的基因工程菌構建及其優化研究

周潔靜

（崇左市動物疫病預防控制中心，遼寧崇左 532200）

β-丙氨酸是非蛋白氨基酸[1]，不僅是一種醫藥中間體，可以作為維生素B5、泛酸鈣、胍基丙酸和肌肽等藥物的原材料，還可以作為食品添加劑，改善食物味道，提高產品質量。β-丙氨酸在機體的糖酵解過程中參與輔酶A的合成，而輔酶A在機體中能夠起到激活機體免疫力的功能[2]，促進機體結締組織的修復和形成。β-丙氨酸一般采用化學方法合成，但這種方法生產的β-丙氨酸中含有大量的無機鹽雜質，純度低，純化后去掉雜質產量更低[3]。

β-丙氨酸的合成專利在國外，國內使用β-丙氨酸時需要負擔一部分專利費用，在大量使用的情況下成本投入也高，運用構建工程菌的方式生產β-丙氨酸，能夠降低污染，降低成本，雖前期構建工程菌用時長，但工程菌構建成功后，后期只需投入細菌生長所需要的營養，憑借細菌生命周期短但繁殖速度快的特點，就能夠得到源源不斷的目的產物。根據工程菌種的不斷優化應用，隨著產能的不斷提升，經濟效益也能進一步的提高。

基因工程菌生產氨基酸有較多的優勢，比如目的性強，工作量小，局限性不多。具體應用時是利用DNA重組技術，對基因進行定向誘變，然后選擇和培育我們需要的基因工程菌。就目前來說，可以利用基因工程菌合成L-色氨酸及其衍生物， L-蘇氨酸， L-異亮氨酸等。

枯草芽孢桿菌可以在特定條件下產生芽孢，是革蘭氏陽性菌，菌落表面粗糙，繁殖速度快，具有鞭毛，顯微鏡下觀察有活動能力[4]。因為枯草芽孢桿菌可以在極端條件下，誘導產生芽孢，抗逆性很強，而且芽孢可以表達許多酶類和生長因子等多種蛋白，所以可應用在基因工程菌方面。其作為基因工程受體菌，可表達出近200種原核和真核生物來源的蛋白基因，所以應用比較廣泛。

1 材料與儀器

1.1 試劑

枯草芽孢桿菌，歐科拜克生物科技股份有限公司；大腸桿菌，上海魯微科技有限公司；質粒，愛迪基因；載體和引物為自行設計，由上海生物工程公司合成發回；限制性核酸內切酶，上海聯邁生物工程有限公司生產；熱穩定性DNA聚合酶，威海同豐海洋生物科技有限公司生產；T4DNA連接酶，北京百奧萊博科技有限公司；膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；PCR產物回收試劑盒Maker蛋白Maker和DNA檢測Maker，上海代軒生物科技有限公司；DNA提取試劑盒、buffer（Mg2+）和DNTp，上海生物工程公司生產；蛋白胨、營養瓊脂，分析純，廣東環凱微生物工程有限公司；酵母膏，分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司；蒸餾水。

1.2 培養基配方

蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g，用可溶性淀粉調節溶液pH至7.0，蒸餾水定容至1000 mL。

1.3 儀器

0.1 ～2.5 μL移液槍、0.5～10 μL移液槍，Eppendorf；ULPHW-I型ULPHW超低有機物（TOC）超純水機，四川優普超純科技有限公司；LDZM-40KCS型高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；veriti96PCR儀，美國ABI；DYCZ-24KF型四板垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-450D型細胞超聲波破碎儀，美國BRANSON；VM200型漩渦振蕩儀，托摩根生物科技有限公司；DCW-3510臥式低溫恒溫槽，上海左樂儀器有限公司。

2 工程菌構建過程

2.1 引物設計與反應體系

用primer5.0設計能夠擴增出panD基因的引物，用細菌DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，反應體系50 μL：模板2 μL、上下引物各1.5 μL、10 倍 Buffer（Mg2+）5.5 μL、dNTPs 2 μL、Taq 酶 0.5 μL、超純水 37 μL。

將混合體系放入PCR擴增儀中進行擴增，溫度設置為：預變性95℃，5min；變形94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s，30個循環；延伸72 ℃，30 s；終延伸72 ℃，10 min；保存 4 ℃；

2.2 檢測回收與篩選

進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收panD片段，將回收的片段與3種載體分別連接，并制備好大腸桿菌的感受態細胞。為了將3種重組構建載體和片段的連接物成功轉移至大腸桿菌內，需提前制備好LB培養基滅菌冷卻后，在無菌條件下最大程度上接種2%的菌液，經過培養箱培養后通過藍白斑篩選法篩選出成功轉化的大腸桿菌菌落，挑取菌落，再次進行PCR驗證，用試劑盒提取其中的質粒進行測序[5]。

2.3 工程菌構建

實驗中選取Hind Ⅲ和EcoR I兩個酶切位點分別對質粒和表達載體進行雙酶切，使表達載體和細菌質粒具有相同的末端，并用T4噬菌體連接酶連接[6]。將構建好的基因表達載體導入大腸桿菌內，得到能夠產生β-丙氨酸蛋白的工程菌。

2.4 工程菌優化

對枯草芽孢桿菌中提取的目的基因進行優化，主要針對其密碼子panD進行序列優化，提高目的片段和大腸桿菌的融合度[7]。相應提升目的基因的表達和擴增速度，PCR擴增時設計程序由40 s改為30 s，隨著試劑和儀器的更新，縮短反應體系時間也不會對反映效果造成影響[8]。一套反應結束能有15 min的結余，節省了時間，提高了工作效率。

2.5 蛋白表達

得到工程菌后應立即檢驗β-丙氨酸是否能夠進行正常表達，菌液接種培養基后，37 ℃條件下，設置搖床以180 r/min的速度對菌液進行搖床震蕩培養。每隔一段時間對菌液進行檢測，當菌液檢測OD值達到0.5左右時停止培養，向培養基中加入IPTG誘導劑誘導隔夜。收集繁殖后的菌體，用超聲破碎儀進行細菌的細胞破碎，隨后通過超速離心得到上清液和沉淀物，用SDS-PAGE進行目的蛋白的檢測。也可以選擇將重組菌液直接接種于自動誘導培養基中，30 ℃左右培養過夜。經過誘導之后的菌液中加入10 mL L型天冬氨酸在相同的條件下進行培養和全細胞轉化，1 h后取1 mL菌樣加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 mL終止反應。

3 結果與分析

取800 μL樣品，根據試劑說明書要求，加入A、B衍生劑，旋渦震蕩儀震蕩3 min，靜置45～60 min，用等體積的正丁醇對轉化的菌液進行萃取，萃取后的液體用HPLC的方法檢測β-丙氨酸。

本實驗通過上述方法一共構建了3種工程菌，3種工程菌進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后發現一號重組工程菌的表達量最差，可溶性最低；2號重組工程菌可溶性最好，表達量較差；3號工程菌可溶性一般，表達量最高。從三種工程菌的表達量和可溶性的差異性來分析原因可能是：（1）不同載體和枯草芽孢桿菌的目的基因親和力有差異。（2）某些載體上自帶的蛋白標簽對重組蛋白的表達途徑產生阻礙作用。（3）工程菌受體和構建的基因表達載體融合度不夠，導致表達量較少。

本實驗對工程菌的最初構造目的就是能夠得到大量的β-丙氨酸,故在做篩選時目的蛋白的表達量是首要考量，雖然3號菌種的可溶性稍差一些，但是綜合考量下，目前情況下第三種工程菌為最優選擇。

4 結論

本實驗通過構建工程菌的方式來生產β-丙氨酸，在降低了污染，保護了環境的同時也降低了投入成本。雖然前期構建工程菌時的篩選選育等過程用時長，但工程菌構建成功后，后期只需投入細菌生長所需要的營養，憑借細菌生命周期短但繁殖速度快的特點，就能夠得到源源不斷的目的產物。這種產能方式能夠與機械化流程相結合，節省人工成本，高效獲得目的產物，根據工程菌種的不斷優化應用，產能不斷提升，經濟效益能夠有進一步的提高。