正交試驗法優化紅掌‘阿拉巴馬’葉片的組織培養體系

向丹 喻娜 趙靜 崔帥

摘要：以紅掌品種阿拉巴馬的葉片為材料，采用正交試驗，通過極差分析和方差分析，對紅掌愈傷組織誘導和不定芽分化條件的培養基種類、激素種類和濃度、活性炭（Activated carbon，AC）濃度進行優化，以探索阿拉巴馬的葉片組培快繁的最適體系。結果顯示，培養基種類、6-BA，2，4-D對葉片愈傷組織的形成產生顯著作用，影響程度依次為培養基種類>6-BA>2，4-D，愈傷組織誘導最適的培養基組合為1/2MS+2.0mg/L IBA+0.6mq/L 2，4-D，愈傷組織誘導率為88%;6-BA、IBA，AC對不定芽分化誘導產生顯著作用影響程度依次為IBA>6一BA>AC，不定芽分化最適的培養基組合為MS+I.5mg/L 6-BA+0.6mq/L IBA+lg/L Ac，不定芽分化誘導率為91%。研究結果對紅掌‘阿拉巴馬葉片的組織培養體系進行了優化，為實現紅掌的標準化組培快繁提供試驗依據。

關鍵詞：紅掌‘阿拉巴馬;葉片;組織培養;正交試驗

紅掌，又名大葉花燭、安祖花、幸運花等，是天南星科花燭屬的多年生常綠草本植物。紅掌花朵為佛焰苞，色澤艷麗，花色多且花期長，葉柄長，葉形獨特而具光澤，是觀花觀葉皆宜的世界名貴花卉。在國內，紅掌已經成為極具觀賞性和商業開發價值的高檔切花和盆栽花卉種類，市場需求量大，培育技術應用價值高。

紅掌傳統的繁殖方式為種子繁殖和分株繁殖，傳統方法繁殖速度慢，已經不能滿足市場對紅掌的需求。隨著現代生物學技術的發展，植物組織培養技術具有保留親本優良性狀、繁殖速度快的優點，已在植物育種方面廣泛運用，也已經成為紅掌快繁的主要途徑。目前，國內有關紅掌組培的研究報道較多，但是在許多報道中未明確紅掌的品種，而不同紅掌品種、不同外植體部位等需要的組織培養條件是相差很大的，從而導致紅掌組培仍然存在許多問題，如不同研究中紅掌的組培方法差異大，甚至存在相反的結果，組培方法的重現性差，愈傷組織誘導和不定分化是影響紅掌組培快繁的主要因素。

正交試驗設計是一種研究多因素多水平的試驗方法，可以在多個影響因素中選出代表陛強的試驗組合，優化試驗方案，比單純的觀察和測量更加精確和更具說服力。以紅掌品種阿拉巴馬的葉片為材料，對紅掌愈傷組織誘導和不定芽分化條件的培養基種類、激素種類和濃度、活性炭濃度進行優化，旨在通過正交試驗設計，尋找紅掌阿拉巴馬葉片組織培養過程中愈傷組織誘導和不定芽分化的最優培養基組合，以優化紅掌的組培快繁技術。

1材料與方法

1.1試驗材料

從廣安市花卉市場購買紅掌阿拉巴馬植株，選取生長健壯植株的幼嫩葉片作為外植體，進行愈傷組織誘導試驗，再選取愈傷組織開展不定芽誘導分化試驗。

1.2外植體的選取與消毒

從生長健壯的植株上剪下展葉約2周的幼嫩葉片，用洗潔精洗凈葉片表面，在流水下沖洗30min，吸水紙吸干葉片表面水分，用0.1%的HgCI2消毒5min，無菌水沖洗5次，置于超凈臺盛有無菌水的無菌瓶中備用。

1.3愈傷組織的誘導

在超凈工作臺內切去外植體與藥液接觸的傷口，用解剖刀把葉片切成1cm×1cm大小，接種至愈傷誘導培養基內。愈傷組織誘導培養基采用L9（34）正交設計，設3個因子、3個水平（表1），每瓶接種3個外植體，每個處理接種20瓶，3次重復。50d后統計愈傷組織的誘導率。

1.4不定芽的分化

待誘導出的愈傷組織生長至直徑約為1.0～1.5cm時，將其切下接種至誘導不定芽分化的培養基中進行繼續培養。不定芽分化培養基采用L9（34）正交設計，設3個因子，3個水平（表2），每瓶接種3個不定芽，每個處理接種10瓶，3次重復。在繼代培養60d后，統計不定芽分化的情況。

1.5培養條件

培養基pH值為5.8，瓊脂為6g/L，蔗糖為3%。不定芽分化誘導均以MS作為基礎培養基。接種后的培養瓶置于組培室內，溫度為（25±2）℃，光照強度為1500Lx，光照時間為12h/d。

1.6數據處理與分析

試驗數據在Excel軟件上處理后，再用SPSS軟件進行分析。

愈傷組織誘導率（%）=誘導出的愈傷組織數目，接種的外植體數目×100;不定芽分化率（%）=分化不定芽的愈傷組織數，接種的愈傷組織總數×100。

2結果與分析

2.1紅掌愈傷組織誘導條件的優化

2.1.1培養基種類對紅掌葉片愈傷組織誘導的影響。以1/2MS、MS和N6培養基對紅掌葉片進行愈傷組織的誘導，結果表明，3種培養基作用存在顯著差異（p<0.05），誘導效果依次為112MS>MS>N6（表3、表4），由此可知，以1/2MS作為培養基進行紅掌葉片愈傷組織誘導的效果較好。

2.1.2 6-BA對紅掌葉片愈傷組織誘導的影響。6一BA濃度對紅掌葉片愈傷組織誘導率的影響效果表現為2.0 mg/L>1.0mg/L>3.0mg/L（表3、表4），說明6一BA在培養基中的濃度以2.0mg/L為佳，濃度過低不利于愈傷組織的誘導，濃度高于2.0mg/L會使愈傷組織的誘導率下降，6-BA對紅掌葉片愈傷組織的誘導作用存在顯著差異（p<0.05）。

2.1.3 2，4-D對紅掌葉片愈傷組織誘導的影響。2，4-D濃度對紅掌葉片愈傷組織誘導率的影響效果表現為0.6mg/L>0.2mg/L>1.0mg/L（表3、表4），說明2，4-D在培養基中的濃度以0.6mg/L為佳，低濃度對愈傷組織的誘導效果不明顯，濃度高于0.6mg/L會使愈傷組織的誘導率下降，2，4-D對紅掌葉片愈傷組織的誘導作用存在顯著差異（p<0.05）。

由極差分析可知（表3），培養基種類、6-BA濃度、2，4-D濃度3個因素的極差值大小分別為培養基>6-BA>2，4-D，表明培養種類是對愈傷組織誘導影響最大的因素，2，4-D濃度是對愈傷組織誘導影響最小的因素，這3個因素對愈傷組織誘導率影響的順序依次為培養基種類>6-BA濃度>2，4-D濃度。而且，A因素在第1水平的k值大于第2、3水平的k值，B、c 2個因素在第2水平對應的k值均大于第1、3水平的k值。由此確定愈傷組織誘導培養基的最優組合為A182C2，即I/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L 2，4-D。依據正交試驗結果，配制最優組合培養基進行驗證試驗，紅掌阿拉巴馬葉片的愈傷組織誘導率為88%，說明正交試驗結果較好，該培養基組合為最優愈傷組織誘導培養基。

2.2紅掌不定芽分化條件的優化

2.2.1 6-BA對紅掌不定芽分化率的影響。不同用量的IBA對紅掌不定芽的誘導作用存在顯著差異（p<0.05），誘導效果依次為1.5mg/L 6-BA>2.5mg/L6-BA>0.5mg/L 6-BA（表5、表6），表明IBA在濃度為1.5mg/L時對不定芽的誘導效果最佳，濃度過低不利于不定芽的誘導分化，高于1.5mg/L會降低不定芽的分化率。

2.2.2 IBA對紅掌不定芽分化率的影響。IBA濃度對紅掌不定芽誘導率的影響效果表現為0.2mg/L>1.0mg/L>0.6mg/L（表5、表6），說明IBA在培養基中的濃度以0.2mg/L為佳，IBA對紅掌不定芽的誘導作用存在顯著差異（p<0.05）。

2.2.3活性炭對紅掌不定芽分化率的影響。活性炭濃度對紅掌不定芽誘導率的影響效果表現為1.0g/L>5.0g/L>3.0g/L（表5、表6），說明活性炭在培養基中的濃度以1.0g/L為佳，濃度升高會使不定芽的分化率下降，活性炭對紅掌不定芽的誘導作用存在顯著差異（p<0.05）。

由極差分析可知（表5），6-BA、IBA、活性炭3個因素的極差值大小分別為Y>X>Z，表明IBA是對紅掌不定芽誘導影響最大的因素，活性炭濃度是對紅掌不定芽誘導影響最小的因素，即這3個因素對紅掌不定芽分化率影響的順序依次為IBA濃度>6一BA濃度>活性炭濃度。x因素在第2水平的k值大于第1、3水平的k值，Y因素在第1水平的k值大于第2、3水平的k值，z因素在第1水平對應的k值大于第2、3水平的k值，因此，結合各因素極差大小，紅掌不定芽分化誘導培養基的最優組合為YIX221，即MS+I.5mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+I.0g/L活性炭。依據正交試驗結果，配制最優組合培養基進行驗證試驗，得到紅掌阿拉巴馬葉片的不定芽誘導率為91%，說明正交試驗結果較好，該培養基組合為最優不定芽分化誘導培養基。

3結論與討論

正交試驗在植物組織培養的研究中已經被廣泛應用，該試驗通過正交設計探討了不同培養基、激素和活性炭對紅掌阿拉巴馬葉片組織培養的作用。試驗結果表明，培養基種類、激素種類和濃度對紅掌愈傷組織的誘導有重要的影響，其中以培養基種類的影響最顯著，說明培養基成分是影響紅掌愈傷組織誘導的主要因素，這與林茂等研究報道結果一致。1/2MS基本培養基滿足了紅掌葉片最基本的生理活動，還需要搭配合適的植物激素以滿足愈傷組織的形成和增殖。6-BA是植物組織培養過程中常用的細胞分裂素，2，4-D是對愈傷組織誘導形成效果較好的生長素。正交優化試驗結果表明，各因素作用效果依次為培養基種類>6-BA濃度>2，4-D濃度，培養基組合為1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.6mg/L2，4-D。

在愈傷組織形成之后2，4-D對不定芽的生長有抑制作用，因此在誘導不定芽分化時選用IBA作為生長素。紅掌次生代謝會產生較多酚類物質，容易引起組培過程中外植體發生褐化，影響不定芽的分化，活性炭是良好的吸附劑，可以有效抑制外植體褐化病提高不定芽的分化率。正交優化試驗結果表明，影響不定芽分化因素的作用效果依次為IBA>6-BA>活性炭，培養基組合為MS+1.5mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA+1.0g/L活性炭。

在后續的研究中可將外植體部位也作為一個試驗因素，探尋紅掌阿拉巴馬組培的最適外植體部位，進一步探討各因素之間的交互作用，精確各因素用量的最佳組合，并將這種研究思路推廣至其它紅掌品種，為實現紅掌組培快繁的標準化和大規模繁殖提供理論依據。

（收稿：2019—10—28）