血清蛋白質組學技術及在腫瘤研究中的應用進展

喻小燕 石星云 陳鋒菊

(1、湖南信息職業技術學院,湖南 長沙410200 2、湖南省腫瘤醫院，湖南 長沙410013 3、湖南第一師范學院,湖南 長沙410205)

蛋白質組(proteome)是指“1 個細胞或1 種組織其基因組所能表達的全部蛋白質”，是1994 年由澳大利亞Macquarie 大學的Wilkins 與Williams 提出的[1-2]。蛋白質組學是指以蛋白質組為研究對象，從整體的角度，分析細胞內動態變化的蛋白質組成及其活動的規律[3]。而血清蛋白質組學是近年來眾多蛋白質組學中非常重要的分支之一，主要是研究如惡性腫瘤患者等特定人群的血清中表達的所有蛋白質，并在此基礎上建立正常蛋白表達譜（PEM），找出不同的蛋白點，鑒定和發現疾病相關蛋白，為研究疾病發生機制、早期篩選或診斷標志物、治療靶點等探尋新方法。血清是血漿凝固后析出的上清，其組成非常復雜，有近萬種蛋白質，富含各種蛋白質和一些小分子，如鹽、脂類、氨基酸、糖等。血清中的蛋白質能反映機體中細胞器官等運轉狀態是否異常，蘊含著與疾病的發生發展機制、早期診斷、藥物治療靶點、治療效果監測緊密相關的大量信息。生理醫學諾貝爾獎獲得者Lee Hartwell 博士指出：尋找腫瘤標志物，特別是其中的蛋白標志是早期診斷癌癥的最新、最有效的方法，而驗血診斷簡便易行[4-5]。蛋白質組學技術的不斷進步、發展和完善為尋找血清中與腫瘤相關的蛋白質及探尋腫瘤發病機制、療效評估等提供了新的方法和技術平臺。

1 血清蛋白質組學研究的基本技術

1.1 雙向凝膠電泳- 質譜技術(2-DE-MS)

雙向凝膠電泳簡稱雙向電泳，是蛋白質組學研究最基本最常用的實驗技術[6]。它是由OFarrell 等于1975 年最早建立，其基本原理為：在相互垂直的兩個方向上，根據蛋白質等電點和蛋白質分子量的差異，先利用等電聚焦電泳分離不同等電點的蛋白質，再采用十二脘基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，最終把不同蛋白質徹底分離。這種技術因使用膠條不同，分離蛋白質量也會隨之發生變化，利用PH3-10 的梯度膠條可以分離差不多一至三千個蛋白質，而如果使用較窄的膠條PH4-7 可以分離出更多的蛋白質。雙向電泳具有高通量、高靈敏度、較高分辨率、有一定重復性，以及能與質譜聯用等優點，在血清蛋白質組學研究中得到了廣泛的應用。

1.2 差異凝膠電泳- 質譜技術(2D-DIGE-MS)

差異凝膠電泳技術是基于二維凝膠電泳的一項重大創新，其基本方法為：用不同的熒光染料對兩個樣品的蛋白質進行標記后混合，再進行二維凝膠電泳。由于兩種熒光染料的波長相異，兩種樣品可在同一塊膠上分離，其含量差異也能準確測出。由于是在同一個二維凝膠樣品中來分離，能夠有效地減少經典的二維凝膠電泳中的偶然性，也能在一定程度上克服重復性不夠好的缺點，較大程度提高了結果的準確度、可靠性、重復性和工作效率[6-7]，而且此技術可檢測到100-200pg 的蛋白質，蛋白質亞型也有可能檢測出來，這相對于其它蛋白質組技術來說，具有明顯優勢。

1.3 液相色譜一質譜聯用技術(LC-MS/MS)

液相色譜質譜聯用是將待分析的復雜蛋白質樣品經蛋白酶消化后，然后用一維或多維色譜進行預分離，用質譜對肽段混合物進行鑒定分析。高效液相色譜（HPLC）質譜聯用是以經典的液相色譜法為基礎，發展起來的分離分析技術，HPLC 分離的液體多肽混合物在高壓下通過細針孔[8-9]，進行質譜分析。HPLC 為復雜蛋白質的分離提供了一種高效的分離方法，依據蛋白質生物學、理化性質的不同，高效液相色譜具有如離子交換色譜、反相色譜、親和色譜（AC）等許多不同的分離模式。一維液相分離系統能較好的分離簡單的生物大分子混合物，但因受到其分離模式所能提供的分辨率和峰容量等因素影響，分離較為復雜的蛋白質、多肽混合物等還是受到一定的限制。目前，大家逐漸采用多維色譜分離技術，并將其與質譜聯用技術相結合，以彌補2-DE-MS 的不足，多維液相分離系統可以不做蛋白質變性等預處理，因此在預處理過程中有些可能丟失的蛋白也可檢測出來，還能等同分離低豐度蛋白質、高豐度蛋白質，也能分離疏水難溶性蛋白質、低含量蛋白質，并且可重復性好、自動化程度高，為發現、篩選新的與腫瘤相關的血清蛋白標志物打下了良好的基礎。

1.4 表面增強激光解析離子化- 飛行時間質譜技術（SELDI-TOF-MS）

SELDI-TOF-MS 是一種基于親和力的質譜分析方法。其基本原理是：利用特定的探針表面或芯片直接捕獲待測樣品中的蛋白質分子，洗脫非特定結合蛋白，利用脈沖氮激光能量將捕獲的靶蛋白從芯片表面電離出來，根據其在電場中飛行時間的不同，繪制成質譜圖，樣品中各種蛋白質的分子量、含量等信息可通過分析軟件處理其檢測結果而獲得。SELDI-TOF-MS 有許多優點：可以直接檢測未經處理的粗樣品，如血清，鑒定特異標志物和分離蛋白質，對樣本需要量少，分析速度快，一般幾十分鐘就能完成，可以分析2-DE 技術不能分析的蛋白質，對含量級微的蛋白，即使含量水平為10-18，只要能夠與表面探針有效結合，都能有希望檢測到，大大提高了低豐度蛋白的檢出率[10-11]。SELDI 技術因其能夠全自動、大規模、粗樣品、極微量、較高通量篩選蛋白質，已被廣泛應用于尋找特異蛋白質或生物標志物，尋找不同類型的組合蛋白質質譜，進行相關疾病的研究和診斷。

血清蛋白質組學研究技術種類繁多，各有優缺點。單一的技術平臺已經很難達到最佳的分離鑒定效果，即使是同一類技術平臺也必需根據樣品進行適合的選擇，如色質串聯進行蛋白質定性定量分析，就有穩定性同位素親和標簽法技術(ICAT)、氨基酸代謝標記技術(AACT)、還有功能強大的同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)等，ICAT 技術在定量及差異表達檢測上有較大的優勢，但也存在一些缺陷，如這一技術無法檢測不含半胱氨酸的蛋白質，而iTRAQ 技術在分析不同樣品時，重復性和精確性很好，在一定程度上又彌補了ICAT 技術的不足，被廣泛應用于血清差異蛋白分析疾病標志物及醫藥領域[12-13]。不同技術平臺和研究策略的結合，可以最大限度地達到最佳的分離鑒定效果。例如，在選擇去除高豐度蛋白質、樣品預分離系統、分離系統、質譜系統等時，進行適當的比較、修改和調整，以達到最佳的研究策略。

2 血清蛋白質組學在腫瘤研究中的應用

2.1 腫瘤特異血清標志物尋找

從蛋白質組學的角度上講，腫瘤可以被認為是一種蛋白質缺陷病，其發生、發展過程中分泌的一些關鍵調節蛋白在血清/血漿中會有量或質的變化，這些蛋白質與腫瘤的發生、發展有著密切的關系。蛋白質組學技術具有高通量的特點，它能篩選腫瘤在發生發展各階段中基因表達的各種蛋白質，尤其是組織與體液中與腫瘤相關的低豐度蛋白質，從而可以發現與腫瘤相關的標志性蛋白質分子。由于血清樣本獲取相對簡單，且采集過程基本上不對研究對象造成傷害，越來越多研究人員以血液為樣本，應用蛋白組學技術尋找和篩選腫瘤特異血清標志物。Rui 等[14]通過雙向凝膠電泳和質譜技術對乳腺癌患者和健康人員血清比較分析時，發現表達差異明顯的2 種蛋白質，分別是在乳腺癌患者血清中表達明顯下調的14-3-3Sigma 蛋白，上調的熱休克蛋白27，而用這2 種蛋白質對患者進行篩查時，兩種蛋白的敏感性和特異性分別為100%和97%，提示血清蛋白質可用于高危人群和一般人群的篩查。Kadowaki M[15]等對乳腺癌患者血清蛋白質進行研究時，采用不同分離分析技術，經雙向凝膠電泳、LC-MS/MS 鑒定出33 個差異蛋白，Western blotting 結果顯示乳腺癌患者血清中玻璃粘連蛋白含量明顯升高，提示其可能是乳腺癌早期診斷的血清標志物。張晨曦，劉曉燕等[16]收集乳腺癌患者和健康人血清各10 例，采用雙向凝膠電泳和質譜技術成功分離鑒定4 個表達差異的蛋白點：錨蛋白-3 亞型X7、keratin、type I cyto-skeletal9 、核膜血影重復蛋白 2 亞型X 11、Dynein heavy chain10 , axonem a1iso-form X9, 這4 種與乳腺癌發生發展可能相關的差異蛋白質，提示可能成為乳腺癌的早期診斷標志物。Ahmed N 等[17]應用雙向凝膠電泳聯合質譜的方法分析卵巢癌患者與健康志愿者血清蛋白質時，鑒定了一些表達差異的蛋白質，如結合珠蛋白和血清轉鐵蛋白，通過檢測這兩種蛋白質在卵巢癌各個病理分期，用化療方式治療前、治療后的表達情況，為卵巢癌的早期診斷和藥物療效監測提供了新的生物標志物。Ramos[18]等采用經典雙向凝膠電泳質譜方法鑒定了一個血清間皮相關蛋白，認為是惡性間皮瘤的潛在腫瘤標志物。這些研究都提示雙向凝膠電泳聯合質譜方法是篩選血清分子標志物的一種強有力的工具。Yu 等[19]利用差異凝膠電泳（2D-DIGE）比較胰腺癌患者和健康志愿者血清標本，質譜鑒定出差異蛋白41 個，其中24 個上調，17 個下調。并驗證發現載脂蛋白E，a-1- 抗胰凝乳蛋白酶、inter-a- 胰島素抑制因子這三個蛋白作為胰腺癌診斷標志的特異性為82.4%-94.1%，但三者聯用診斷時特異性達到了100%。Huang 等[20]應用差異凝膠電泳技術對經用免疫親和層析的去除了高豐度蛋白的乳腺癌和健康人血清進行分析時，發現在乳腺癌患者血清中表達上調的轉鐵蛋白和表達下調的載脂蛋白等，經臨床驗證后，轉鐵蛋白的表達情況與差異凝膠電泳結果一致，結果還表明差異凝膠電泳可以檢測出蛋白質亞型，說明與其他技術相比，差異凝膠電泳具有一定的優勢。Yang Z 等[21]分析乳腺癌和健康人血清時，應用多維凝集素親和色譜分離糖蛋白，HPLC-MS/MS 鑒定分離的酶解片段，不僅發現了在乳腺癌和健康人血清中存在差異表達的與蛋白酶抑制、細胞生長、維持內環境有關的蛋白，還檢測到了低豐度蛋白質HER-2 的表達。Zhang Q[22-24]等篩查腎母細胞瘤患兒血清中的生物標志物時聯用SELDI-TOF-MS、HPLC、2D-LC-LTQ-MS 等技術，發現了可作為兒童腎母細胞瘤中特定的標志蛋白，分別是載脂蛋白C-I 和結合珠蛋白，它們在兒童早期腎母細胞瘤中表達均偏高。這些方法可用于大量篩選血清標志物。最近有報道通過蛋白質組學技術在腎透明細胞癌早期階段的血清中新的發現。zhang Y 等[25]在分析腎癌患者和非癌癥患者血液樣本時，應用iTRAQ 標記和LC-MS/MS 技術進行分析發現，差異表達的30 個蛋白質中，在腎透明細胞癌中HSC71過表達。Geissler K 等[26]研究發現早期腎癌與良性腫瘤、其他泌尿系腫瘤或非癌癥病人血清中，蛋白質獨特表達的有27 種，而且與腎透明細胞癌免疫反應失調有關的為大多數，可作為診斷腎透明細胞癌的生物標志物。Zhang L 等[27]通過與”癌癥基因組圖譜”數據庫交叉驗證，發現差異蛋白質11 種，通過免疫組化驗證證實潛在的生物標志物可能為小型Ca2+結合蛋白S100家族S10A8 和S10A9 ，可用于診斷腎癌和作為潛在的治療靶點。

2.2 腫瘤的發病機制、療效評價、預后評估以及靶向治療

過去，應用血清蛋白質組學技術研究腫瘤主要集中在發現生物標志物和診斷上，近些年，越來越多的研究人員逐漸向探索腫瘤發病機制、治療靶點邁進，以此檢測、分析標志蛋白和靶蛋白，作為腫瘤療效評價、預后判斷及其藥物篩選研究中最新并且最強有力的技術手段。朱敬華等[28]收集晚期肺腺癌患者培美曲塞聯合順鉑方案化療進展組和非進展組的血液，以2-DE-MS 技術成功鑒定到19 個差異蛋白質點，其中丙酮酸激酶M 2 、腺苷酸激酶5 、a-2 抗纖維蛋白溶酶的前體，r 纖維蛋白、氧化固醇結合蛋白相關蛋白3 等可能為化療療效預測的生物標志物。趙冠華等[29]取81 例肺鱗癌患者以應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）檢測初治晚期SCC患者接受紫杉醇類聯合鉑類化療前血清多肽, 并分析其與化療療效的相關性，靈敏度為90.0%,特異性為80.0%。伊力亞爾等[30]應用SELDI-TOF-MS 蛋白質芯片技術分析腎癌手術前后血清蛋白質表達水平的變化，并與SVM等生物信息學相結合，最終篩選出5 種具有臨床意義的蛋白質，Bel-2 家族細胞凋亡調節蛋白、WAP 二硫化四物核心蛋白、Krueppel 樣因子8、單核細胞趨化蛋白、血清β- 淀粉樣蛋白4，這五種蛋白質作為生物標志物，預測腎透明細胞癌的靈敏度為87.5%(35/40)，特異度為86.8%(46/53)，這些蛋白在腎癌發病以及進展過程起著致病角色。通過術后動態監測這些差異性蛋白質，發現他們可作為早期預測、術后復發及轉移的標志物，在腎透明細胞癌的療效評價、預后評估以及靶向治療方面有一定參考價值。Lin 等[31]通過2D-DIGE 比較及質譜鑒定分析胰腺癌患者手術前后血液樣本以及術后一年內病情惡化的患者和未惡化的患者的血液樣本，發現它們之中有候選預后標志蛋白等差異蛋白，對胰腺癌的治療和預后觀察的研究很有幫助。Yang F 等[32]以肺鱗癌的血清蛋白質組分析了腫瘤相關抗原，鑒定出與肺鱗癌相關的抗原有14 種，并驗證了在肺鱗癌中上調的有6 種，提示了他們在肺鱗癌的診斷和治療中的潛在應用價值。馬曉麗[33]等收集52 例診斷明確的局部晚期和晚期食管鱗癌患者治療前、后血清，利用蛋白質技術同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ 技術）篩選食管癌放化療療效相關的篩選出與腫瘤相關、具有核心作用且介導腫瘤相關通路的優勢血清差異蛋白，共篩選出17 個有顯著差異的差異蛋白，其中TF、ADIPOQ、PIGR、CD14 等與食管癌療效相關的重要蛋白質分子群和分子信號通路，為食管癌的精準治療提供新靶點和新策略。FU 等[34]應用蛋白質組技術研究表明，在肝癌組織中，HSP90a 的表達與臨床分期、病理分級、淋巴結轉移、療效監測密切相關。

3 小結與展望

蛋白質組學研究開辟了蛋白質功能和人類疾病研究的新領域，應用血清蛋白質組學技術在腫瘤研究應用取得了一些進展，但相對于蛋白質組學研究誘人的前景來說，目前的研究還很不夠，盡管有很多種血液腫瘤標志物被用于腫瘤的研究臨床上，，如甲胎蛋白（AFP）用于的篩查肝癌高危人群；糖類抗原125（CA125）應用于篩查卵巢癌早期；前列腺特異性抗原（PSA）應用于篩查前列腺癌的早期等。但這些標志物也不是絕對理想的血液腫瘤標志物，他們對特定類型的癌癥并不完全具有特異性，敏感度也不能達到100%，有些標記物水平變化沒有早于臨床診斷，敏感性低，假陽性率低，在臨床應用中，經得住時間與實踐考驗的標志物亦是少之又少。現在還有多種惡性腫瘤如腎癌等沒有可應用于臨床的血清特異性標志物，等待更多研究人員的發現、探尋，或者即使有些腫瘤已有研究人員應用血清蛋白質組開展了不少研究，發現或認為找到了一些腫瘤特異性標志物的蛋白質，但有些標志物特異性差，仍缺乏臨床驗證，應用于作為腫瘤療效評價、預后判斷及其藥物篩選研究也不夠多。應用蛋白組技術發現、尋找腫瘤血清標志物并應用于療效評價、藥物篩選還有巨大潛力和研究空間，隨著血清蛋白質組技術的不斷完善和發展，受高豐度蛋白影響低豐度的測定以及極酸堿性和難溶的蛋白質檢測等的局限減少，多種蛋白質組技術方法的聯用，應用血清蛋白組學技術尋找到腫瘤理想的血清標志物、研究發現腫瘤新的標記物，探索腫瘤治療靶點、探明腫瘤發生、發展的分子機制、仍具有有難以估量的前景。