熊金恩,李壹,熊曉輝
(南京工業大學食品與輕工學院,江蘇南京211800)
重金屬是一種對生物和環境具有嚴重影響的普遍污染物,隨著工業、農業和采礦等各種作業活動的增加,大量的重金屬被排放到地表和地下水中[1]。最為關鍵的是,重金屬容易通過食物鏈系統在動物和人體內累積。這些重金屬元素的積累可能會對黏液組織、腸道、骨骼、中樞神經系統、肝臟、腎臟和生殖系統造成嚴重損害[2]。它們具有產生高反應活性的化學實體的能力,例如產生一些可以引起脂質過氧化、DNA 損傷、蛋白質巰基氧化和其他一些作用的自由基[3]。另外,長期接觸有毒重金屬可能對動物和人體有致癌作用[4]。因此,有毒金屬離子的檢測在環境保護和疾病的預防及治療方面起到十分重要的作用。然而,由于在大多數生物和環境樣品中都存在高濃度的干擾基質成分,對痕量重金屬的高選擇性和靈敏性檢測仍然是一個具有挑戰性的研究領域。因此,從復雜基質中捕獲目標離子是檢測重金屬的關鍵步驟。
近年來,適配體作為生物傳感器受到國內外研究人員越來越多的關注。適配體最初是由3 個獨立小組在1990 年引進,這是一種通過配體指數富集系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)產生的一類人工寡核苷酸探針。它們可以結合多種靶點,包括小分子[5],離子[6],蛋白質[7],細胞[8],組織和生物體[9]。與傳統重金屬檢測方法相比,DNA 具有許多用于金屬檢測的理想特性。首先,DNA是聚陰離子,可以與金屬離子靜電吸引,同時DNA 高度穩定;其次,DNA 在變性后可以復性而不會喪失其金屬結合親和力;第三,DNA 的化學合成的成本低廉,且基本可在任意選擇的位置進行各種修改。最后,通過不同堿基結合可以篩選出不同金屬離子的特異性適配體。尤為重要的是,適配體生物傳感技術可以在大多數具有通用設備的實驗室進行重金屬分析試驗。當然,適配體生物傳感器與傳統方法相比仍然具有結合親和力強、靈敏度高、選擇性優異、穩定性好、免疫原性和毒性低[10]等一系列優點。因此,適配體生物傳感技術越來越成為生物和環境樣品中重金屬離子識別的理想選擇。
目前為止,國內外研究人員已經設計出了一些用于識別和檢測重金屬離子[主要是鉛(Pb),汞(Hg),鎘(Cd),銀(Ag)和砷(As)]的 DNA 適配體,這些離子可以與DNA 的堿基特異性相互作用,形成強而穩定的復合物。此外,國內外研究人員對DNA 和金屬的協調作用已經做了廣泛的研究[11]。在最簡單的水平上,DNA 的磷酸骨架通過靜電相互作用與金屬結合,從而穩定DNA 雙鏈體。然而,在此基礎上,還要考慮到金屬離子和DNA 的化學性質,例如:1A 和2A 族金屬主要與磷酸骨架相互作用從而保持雙鏈DNA 穩定性;第一行過渡金屬Cd2+,Pb2+和三價鑭系元素與磷酸鹽和堿基相互作用;較軟的金屬如Ag+和Hg2+主要與DNA 堿基相互作用[12];一些金屬如鉑和鉻幾乎不可逆地與DNA 堿基結合[13]。據報道,具有非重復富含胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)的單鏈DNA 序列被證實可以與Cd2+結合[14]。一些金屬離子 (K+,Na+,Ca2+和 Pb2+) 可影響富含 G 的DNA,使其發生從無規卷曲到G-四鏈體結構的構象轉變[15]。在Hg2+和Ag+離子存在的情況下,T-T 錯配會選擇性捕獲 Hg2+形成 T-Hg2+-T 復合物[16],而胞嘧啶(C)-胞嘧啶錯配只能識別Ag+形成C-Ag+-C 復合物[17]。陽離子結合核酸并誘導形成二級結構的能力可以歸因于陽離子性質如離子半徑,配位行為和水合作用[18]。
最近,金屬離子-寡核苷酸堿基的配位化學在生物傳感器的發展中受到了國內外研究人員的廣泛關注。由于這些重金屬離子和堿基之間可以進行高度特異性結合,因此,所設計的傳感器可以在其他離子存在的情況下針對靶標離子實現特異性選擇。此外,在這些系統中使用納米材料可以有效地提高它們的性能。隨著納米技術的發展,納米材料越來越普遍地被用作固定適配體的平臺[19]。它們在適配體的累積量、定向和組裝密度控制中起著重要的作用,可以優化檢測體系的識別能力。納米材料也可能會導致電化學生物傳感器中的電子轉移加速[5]。
納米材料,例如金屬納米顆粒,半導體量子點(semiconductor quantum dot,QDs),碳納米材料,二氧化硅納米顆粒和磁性納米顆粒,具有獨特的光學,電子,磁性和催化性質。這些特性使其越來越多的用于構建新型基于適配體結合納米材料的生物傳感器。特別地,納米材料的大表面積與體積比可以使其高效率的結合適配體,從而將檢測信號大大增強并通過協同相互作用提高目標識別性能[20]。此外,大多數納米材料顯示出不同尋常的生物相容性,它們可以保護核酸免受核酸酶消化在生命系統中造成的損害[21],使得適體組裝的納米材料有利于醫學診斷應用。納米材料輔助適體傳感器在傳感應用中顯示出前所未有的優勢,并引起了多學科研究的重大興趣。適配體與納米材料結合主要通過兩種方法,即共價連接和非共價連接。共價連接主要是通過化學吸附,例如:硫醇化的適配體可以很容易地化學吸附到金納米顆粒(AuNP)的表面上[22],而胺標記的適體可以容易地吸附在羧基改性的二氧化硅納米顆粒(SiNP)的表面上。而非共價連接主要利用靜電吸附機制,例如:帶負電荷的適體可以吸附到帶負電荷的AuNP 表面上[23]。
因此,基于不同適體與新型納米材料的組合,已經開發了各種用于重金屬離子檢測的傳感系統。本文將提供一些基于適配體結合納米材料的生物傳感技術分析有毒重金屬離子 (例如 Cd2+,Pb2+,Hg2+,Ag+,As3+)的方法簡介,便于讀者借鑒。
重金屬是一種可導致嚴重生物和環境問題的普遍污染物,一直受到廣大科研工作者的關注。下面列舉幾種常見的有毒重金屬并分別介紹其傳統的檢測方法。
鉛是可能對人體器官和環境造成嚴重影響的最危險的重金屬之一[24]。所有形式的鉛都是有毒的,并且會對生殖,神經,免疫,心血管系統以及兒童發育過程產生危害[25]。據報道[26],血液中Pb2+的最大可接受濃度為10 μg/dL。由于Pb2+的高毒性會對公眾健康產生巨大影響,開發可靠、精確和靈敏的方法來測定食品中痕量的鉛元素對國內外研究人員而言十分有必要。電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)、電感耦合等離子體發射光譜法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)、電熱原子吸收光譜法(electrothermal atomizationatomic absorption spectrometry,ET-AAS)和火焰原子吸收光譜法(flame atomic absorption spectrometry,FAAS)是檢測Pb2+最常用的分析技術。但是,這些技術在分析之前需要對目標離子進行復雜的前處理。在環境、藥物和食品分析領域越來越多的科學家致力于開發新的傳感器來直接、準確、快速和選擇性地測定重金屬[27]。
汞是一種眾所周知的劇毒重金屬,以金屬,無機和有機形式存在。水溶性的Hg2+是無機汞中最穩定和傳播最廣泛的形式之一,其有兩種來源:天然來源和工業排放。汞在食物鏈中積累會對人體產生極其嚴重的健康危害[28]。此外,有機和無機形式的汞都具有神經毒性。據報道,汞引起的神經毒性會導致人的聽力下降、精神惡化、言語障礙、視力受損、前庭功能障礙,甚至使人產生自閉癥[29]。整個血液中的汞濃度通常低于10 μg/L,一般低于 20 μg/L 被認為是正常的,長期暴露于汞蒸氣后,血汞濃度可升至35 μg/L[30]。考慮到環境和生物樣品中汞的含量較低,提高Hg2+檢測的選擇性和靈敏度對分析人員來說尤為重要。為了實現這一目標,國內外研究人員已經開發了許多不同的分析方法,包括中子活化分析(neutron activation analysis,NAA),冷原子熒光/吸收光譜法(cold-vapor atomic fluorescence spectrometry,CV-AFS/cold-vapor atomic absorption spectrometry,CV-AAS),ICP-MS,ICP-OES,極譜法等[31]。
砷是一種廣泛分布于世界許多地區的有毒致癌物質。雖然砷在自然界存在不同的化學形式,但As3+被認為是元素毒性最強的形式[32]。人類可能會通過直接和間接的方式攝入砷,也就是說,土壤中的砷會積累到農作物中,同時受污染的飲用水中也會有砷。砷會在角蛋白含量高的組織中積累,如皮膚、頭發和指甲[33],并且許多疾病與砷的積累有關,如皮膚損傷,癌癥和循環系統問題[34]。目前,常用的砷檢測方法有色譜法,光譜法和電化學方法[35]。
鎘是毒性最強的金屬之一,它可以通過地球的食物鏈系統在動物和人體中進行生物積累。急性鎘中毒的癥狀包括高血壓、腎臟損害、貧血、癌癥等[36]。血液中可接受的 Cd2+濃度約為 5 μg/L~10 μg/L[37]。ICP-OES,ICP-MS,ET-AAS,FAAS 和電位滴定法等幾種方法是鎘檢測的常用方法[36]。
與大多數其他重金屬相比,銀化合物的毒性較低,因為它們在消化時人體只會有很少量的吸收[38]。然而,某些銀化合物大量存在的情況下會具有毒性。由于銀離子對硫氫鍵和氨基有很強的親和力,因此在體內銀離子會與氨基酸,核酸和其他化合物發生絡合作用[39]。此外,銀離子具有生物活性并容易與哺乳動物和真核細胞膜上的受體相互作用[38]。正常情況下,人體血清中 Ag+的含量低于 2 μg/L[40]。目前來說,ICP-OES、ICP-MS、ET-AAS、FAAS 和電化學方法等各種檢測技術已被廣泛用于選擇性地檢測Ag+[41]。
目前,重金屬檢測的傳統方法雖然應用比較成熟、靈敏度高,但同時也存在諸多局限性,如:儀器價格昂貴、操作復雜、耗時長,需要專業人員操作等[42]。難以滿足簡單、快速、實時檢測的實際需要[43]。因此,尋求一種簡單、快速、靈敏的重金屬檢測方法具有非常重要的意義。
現如今,適配體一直被認為是對重金屬進行生物和環境監測中非常有前途的工具。生物傳感器是一種快速簡單的方法,而且,其具有很高的靈敏度和選擇性。例如:Pb2+和富含G 的適配體具有高度特異性結合能力[44],即便是對于已知的可以穩定G-四鏈體的陽離子,如 Na+、K+、Ca2+,也僅僅顯示出稍高于背景的信號[45]。由于具有特異性的T-Hg2+-T 相互作用,基于富含T 的適配體的生物檢測系統可以實現在其他金屬離子存在的情況下對汞離子進行特異性檢測[46]。Kim 等[47]基于SELEX 過程對配體進行系統地優化,使用親和柱在體外篩選了可結合砷的DNA 適配體。這種單鏈DNA 適配體含有100 個核苷酸,對As3+具有非常高的親和力,解離常數為7.05 nmol/L。
隨著國內外研究人員對寡核苷酸與金屬離子之間相互作用的深入研究,適配體分子已被認為是用于構建 Pb2+、Hg2+、As3+、Cd2+等重金屬檢測的電化學生物傳感器的強有力受體。Jarczewska 等[48]開發了一種靈敏度高、選擇性好的安培檢測平臺,以亞甲基藍為指示劑,測定Pb2+,亞甲基藍可與帶負電荷的磷酸骨架和G-四鏈體(G4)環形成氫鍵或產生陽離子-偶極相互作用。它可以有效地插入到形成的G4 中,產生容易測量的“增強”的電化學信號,而且G4 的量取決于Pb2+的濃度。該傳感器對Pb2+的電化學響應范圍為0.05 μmol/L~1 μmol/L,最低檢出限為 34.7 nmol/L。Lin 等[49]報道了一種基于Hg2+與T-T 錯配而形成T-Hg2+-T 復合物的阻抗適配體傳感器用于測定Hg2+。電荷轉移電阻(ΔRCT)在 0.1 nmol/L~1×104nmol/L 范圍內與 Hg2+濃度的對數呈線性關系,檢出限為0.1 nmol/L。Wen 等[50]介紹了基于As3+的特異性結合適配體(specific binding probe,SBP)建立的伏安法測定砷As3+的電化學檢測方法。首先,SBP 與金電極表面上的捕獲探針(capture probe,CP)雜交。然后,指示劑亞甲基藍插入到電極上的SBP/CP 混合物中。加入As3+后,它特異性地與SBP 結合,這導致SBP 的構象變化,從而使SBP 從電極上解離到溶液中。因此,電極上殘留的MB 量減少,從而降低了MB 的峰值電流。該方法在 0.1 μg/L~200 μg/L 濃度范圍內對As3+具有線性響應并且檢出限低至75 ng/L。Lin等[49]報道了一種基于Ag+與C-C 錯配以形成C-Ag+-C復合物的阻抗適配體傳感器。結果表明:100 nmol/L~800 nmol/L 范圍內ΔRCT與Ag+濃度的呈線性關系,檢出限為10 nmol/L。
納米材料的引入可以有效提高適配體的固定量。此外,它們在適配體的取向和組裝密度控制中發揮重要作用,以實現最佳識別能力。近年來,將適配體與納米材料結合使用的分析方法受到越來越多的關注。Xu等[51]用富含G 的鉛特異性適配體作為Pb2+的識別元件,利用銀鉑納米顆粒修飾的金屬有機骨架作為電化學信號增強子,開發了無標記、無酶的Pb2+電化學適配體。將適配體溫育到修飾的電極表面上,若不存在Pb2+,通過雜交反應,未折疊的適配體在電極表面捕獲了其互補鏈,而互補鏈結合了金屬有機骨架可提供電化學信號,在Pb2+存在的情況下,適配體會折疊成穩定的G-四鏈體結構,難以結合其互補鏈從而導致電化學信號變化。此項研究開發的適用于Pb2+的適配體表現出了從0.1 pmol/L~100 nmol/L 的寬線性范圍,檢出限為0.032 pmol/L,特異性好,穩定性強,重現性好。Babamiri 等[52]設計了用于選擇性檢測Hg2+的超靈敏電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)適配體檢測方法。固定在修飾后的四氧化三鐵枝狀聚合物(Fe3O4@SiO2/QDs)上的富含 T 的單鏈 DNA(S1)和修飾了 AuNPs 的互補適配體(AuNPs-S2)雜交,QDs 納米復合物的ECL 被有效猝滅,而在Hg2+存在的情況下,由于穩定的T-Hg2+-T 復合物的形成,AuNPs-S2被釋放,這樣QDs 的ECL 信號再次得到恢復。在最佳條件下,該適配體傳感器用于Hg2+檢測,線性范圍為20 amol/L至2 μmol/L,檢出限為2 amol/L。他們又將該適配體傳感器用于檢測自來水、鯉魚和咸水魚樣品中的Hg2+,結果令人滿意。Wang 等[53]通過構建用于識別Cd2+的特定適配體和還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO)/石墨碳氮化物(graphite carbon nitride nanocomposites,g-C3N4)的復合體系開發了新型傳感器。該電化學生物傳感器對于Cd2+檢測顯示出良好的靈敏度、特異性、重現性和穩定性。線性范圍從1 nmol/L~1 μmol/L,檢出限為0.337 nmol/L。
過去幾年,檢測重金屬的熒光生物傳感器的開發取得了很大進展。Huang[54]等報道了基于超敏感雙鏈DNA 的特異性染料PicoGreen 和無標記寡核苷酸的傳感器。該方法的原理是Pb2+誘導富含G 的凝血酶適配體從無規卷曲變為G-四鏈體,從而阻止該適配體與其互補序列結合形成雙鏈DNA 并引起PicoGreen 熒光強度降低。結果表明,該方法滿足Pb2+最大殘留限量(maximum residue limit,MRL)的要求,線性動態范圍為1 ng/mL 至1 mg/mL 以上,可檢測到Pb2+的最低濃度為1 ng/mL。此外,整個檢測過程可以在不到30 min 內完成。因此,該方法簡單、快速并可用于Pb2+的高靈敏度分析。Sun 等[55]基于磁分離和T-Hg2+-T 堿基對的形成,開發了一種Hg2+的熒光測定法。其設計原理為:將適配體固定在磁珠表面以形成適配體功能化磁珠(aptamers-functionalized magnetic beads,AMB),在不存在Hg2+的情況下,信號轉導探針(signal transduction probe,STP)可以通過互補堿基配對與AMB 組合,磁分離后檢測溶液中幾乎沒有STP,導致熒光信號很弱。Hg2+的存在會形成T-Hg2+-T 堿基對。磁分離后,Hg2+從系統中分離出來,STP 留在溶液中,熒光信號顯著增強。隨著Hg2+濃度從2 nmol/L 增加到160 nmol/L,熒光強度呈線性增加,檢出限為0.2 nmol/L。該方法已成功應用于帶狀魚中Hg2+的測定和定量,回收率良好,結果與原子熒光結果完全一致。
各種納米結構,尤其是量子點是用于熒光生物感應的良好熒光團[56]。此外,金屬納米簇(nanoclusters,NCs)是一類新的材料,可表現出類似分子的光譜行為。金和銀納米簇在檢測各種分析物方面受到相當大的關注[57]。幾種納米材料已經表現出對廣泛熒光團的高淬滅效率,使其可用于基于熒光的生物測定[58]。碳納米管(carbon nanotube,CNT)、氧化石墨烯等納米材料可以有效地猝滅固定到DNA 上的染料的熒光[59]。基于這個特點,國內外研究人員已經開發了多種熒光適配體傳感器來檢測重金屬離子。Zhang 等[60]使用Pb2+的特異性適配體修飾的銀納米團簇(Ag NCs)構建了一種新型熒光生物傳感器。在Pb2+存在下,Pb2+誘導適配體形成G-四鏈體,并使位于3'和5'末端的兩個黑色DNA/Ag NC 閉合,導致熒光增強。該法可以在5 nmol/L~50 nmol/L 的線性范圍內檢測Pb2+,檢出限低至3.0 nmol/L。Abdelhamid 等[61]報道了一種基于Hg2+適配體結合rGO設計的傳感器用來選擇性地檢測Hg2+。其原理是:胸腺嘧啶(T)和Hg2+之間形成復合物然后再在rGO 的表面上形成[Hg(T)2(H2O)2]n絡合物,這導致rGO 的熒光發射被淬滅。所提出的基于rGO 的適配體傳感器的檢測范圍在100 nmol/L~700 nmol/L,并且對于Hg2+檢出限低至5 nmol/L,除了靈敏度高和選擇性好之外,該方法簡單方便、快速直接。Oroval 等[62]基于適配體與介孔二氧化硅納米粒子的組合開發了一種具有高選擇性和強靈敏性的檢測As3+的新型傳感納米探針。制備的納米探針檢出限為 0.9 μg/L,檢測范圍在 4 μg/L~60 μg/L。其數據表明該傳感器其對As3+的較好選擇性,該傳感器在As3+的檢測分析中顯示出巨大的潛力。
在各種光學方法中,比色適配體傳感器由于具有響應快速、操作簡單和靈敏度高的特點而引起了國內外研究人員廣泛的關注。比色法是分析應用的常用方法,因為目標識別僅僅通過肉眼就能看出來[63]。AuNPs因其獨特的特性而被用作用于比色生物傳感器的納米組裝單元,這些特性包括易于合成、獨特的光學、熱學和電學特性和與生物分子的完美相容性[64]。最重要的是,AuNPs 的表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)和膠體穩定性是比色產生的決定因素[65]。具體的現象即為:分散良好的AuNPs 溶液呈紅色,而聚集的 AuNPs 呈藍色(或紫色)。Shahdordizadeh 等[66]介紹了一種用于敏感和選擇性檢測Pb2+的比色法,在不存在Pb2+的情況下,AuNPs 上的雙鏈DNA 可以防止在NaCl 存在下AuNPs 的聚集。然而,在Pb2+存在下,適配體結合Pb2+后,互補鏈被釋放并被核酸外切酶I 裂解,當加入鹽后,AuNPs 溶液的顏色從紅色變為紫色。該法檢出限低至2.4 nmol/L。Taghdisi 等[64]開發了基于聚乙烯亞胺和AuNPs 的Pb2+的敏感、選擇性好和快速的比色適配體傳感器。聚乙烯亞胺可以使AuNPs 聚集,在加入Pb2+后,適配體發生構象變化并形成G-四鏈體適配體/Pb2+復合物,導致AuNP 聚集并且顏色變為藍色。在Pb2+不存在的情況下,適配體會與聚乙烯亞胺結合。因此,AuNPs 保持分散使溶液保持穩定的酒紅色,該法檢出限低至702 pmol/L。Tan 等[67]報道了一種基于適配體-靶標特異性結合和AuNPs 生長的多功能和靈敏的Hg2+比色傳感器。他們先選用15 個A 堿基的適配體(15-mer),Hg2+存在時會與適配體結合,使適配體偏離AuNP 種子的表面,然后用羥胺(NH2OH)和原氯金酸(HAuCl4)反應控制AuNPs 種子的生長,適配體覆蓋度不同的AuNPs 種子生長是不同的,該法得到了9.6×10-9mol/L 的檢出限,隨后他們通過分別增加15-mer 序列的一側和兩側的堿基使AuNPs 的生長發生變化從而使比色信號得到很大改善。對于25-mer和59-mer 的適配體,獲得的檢出限分別為4.05×10-9mol/L和3×10-9mol/L。這種簡單、可視化和低成本的Hg2+傳感器在環境監測方面具有巨大的潛力。Wu 等[68]設計了一種比色適配體傳感器用于As3+的靈敏檢測。其原理是基于二烯丙基二甲基氯化銨 [poly(diallyldimethylammonium),PDDA]、適配體和As3+之間的相互作用可以控制AuNPs 的聚集。在As3+存在下,由于形成了適配體/As3+復合物,導致適配體首先被耗盡,從而PDDA使AuNPs 聚集,進而產生顏色的顯著變化即從酒紅色變成藍色。通過這種方法,As3+在水溶液中檢出限低至5.3 μg/L。此類As3+的生物傳感器將在食品樣品檢測中發揮重要作用。Wu 等[14]基于SELEX 程序使用親和柱體外篩選了可與鎘結合的DNA 適配體(命名為Cd-4適配體)。并提出了一種新型的用于Cd2+檢測的比色方法,該方法基于適配體與水溶性陽離子聚合物-PDDA之間的特殊相互作用從而導致AuNPs 的聚集[69]。該方法已用于檢測水溶液中的Cd2+,檢出限為4.6 nmol/L。Xi 等[70]開發了適配體官能化的金納米粒子,用于Ag+的快速、高選擇性和高靈敏度檢測。該比色傳感器檢測到Ag+的濃度低至0.236 nmol/L。除了寬線性(1 nmol/L~1 μmol/L)和低檢測極限(0.236 nmol/L)外,該傳感器具有近實時(2 min)的分析功能。
功能性核酸自被發現以后,不斷地被用作有效的傳感工具。目前,在分析化學中使用DNA 或RNA 適配體是一個非常有前途的研究領域,因為它們具有與抗體相似的親和力,能夠特異性結合目標。本文介紹了可用于監測生物和環境樣品中 Pb2+、Hg+、Cd2+、Ag+、As3+的各種基于適配體的檢測方法。近年來,因為經濟、敏感度高、選擇性好和易于構建等優點,人們對利用寡聚核苷酸作為識別元件與分析技術相結合的新型檢測方法的興趣日益濃厚。此外,基于納米材料的染料、電化學信號放大器、猝滅劑和吸附劑在改進生物傳感器方面具有著十分光明的前景。因此,基于適配體的檢測,尤其是適配體傳感器與納米材料的結合是一個非常熱門的研究領域,不久的將來,我們將看到其對不同目標進行分析的新的振奮人心的成就。