中性粒細胞胞外誘捕網檢測技術的研究進展

陳玉年，顧兵，李華南

中性粒細胞是人體血液中的主要白細胞群，在非特異性免疫機制中起重要作用。2004 年，Brinkmann等［1］首次證明，中性粒細胞可通過形成一種帶有強大負電荷的網狀結構捕獲病原體，并將該網狀結構命名為中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。中性粒細胞受多種病原微生物、脂多糖、豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol myristate acetate，PMA）、活化的血小板及一些炎性介質刺激后，發生染色質解聚，核膜崩解。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、α 防御素和抗菌肽等顆粒蛋白黏附于解聚染色體，并釋放到胞外形成NETs。其形成通常伴隨著中性粒細胞破壞和病原體的死亡，這一過程稱之為網捕死亡（NETosis）［2］。NETs 概念的提出打開了中性粒細胞在免疫學研究中的新紀元，當前有關NETs 的關注焦點在于NETs與疾病的相關性和網狀結構形成的治療潛力。

NETs與多種疾病的發病和治療存在密切關聯，表現為“雙刃劍”作用。一方面它既能在感染性疾病中防止病原微生物的擴散和起殺滅作用，如金黃色葡萄球菌［3］、肺炎鏈球菌［4］、結核分枝桿菌［5］和呼吸道合胞體病毒［6］等；另一方面NETs是引起部分免疫性疾病的發病因素，如小血管炎［7］、系統性紅斑狼瘡［8］等自身免疫缺陷性疾病。此外，在急性痛風性炎癥反應中，聚集性NETs可通過絲氨酸蛋白酶誘捕和降解白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎細胞因子緩解炎癥反應［9］。目前對NETs在機體不同生理及病理狀態下的形成及作用認識仍較局限，但已經相繼開展了關于NETs在微生物感染的治療、自身免疫性疾病的防治等方面的研究，這將可能為感染、自身免疫性疾病及血栓性疾病提供潛在治療方向。因此，熟悉檢測NETs的方法并合理運用有利于保證NETs檢測的準確性，從而有助于對疾病的診斷以及探索一些新的治療靶點。鑒于目前尚未建立完整的標準化評價系統，本文擬對國內外已經報道的各種NETs檢測方法進行分類，評價其優缺點，為臨床應用提供參考。

1 形態學觀察

電鏡掃描正常中性粒細胞顯示細胞核呈桿狀或2～5分葉狀，葉與葉間有細絲相連，胞漿內含多種小顆粒物質。Brinkmann 等［1］利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察到中性粒細胞在PMA 或脂多糖的刺激作用下形態發生變化。SEM圖像顯示，中性粒細胞被激活后，細胞扁平化，細胞核分葉結構消失，核膜溶解，核內物質釋放到胞質中，隨后質膜崩解，細胞內容物釋放到胞外形成纖維狀結構，其TEM 圖像證實了NETs 無質膜結構包裹。單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體是誘發痛風性關節炎的主要誘因。Schauer 等［10］采用視頻時差顯微鏡記錄了MSU 晶體體外誘導NETs 的形成過程，中性粒細胞的胞核失去原有結構，在此分解過程中，染色質外化，形成與微生物誘導產生類似的網狀結構，證實了痛風性關節炎中存在NETs。Borenstein等［11］利用TEM觀察了細菌刺激口腔中性粒細胞的形態學特征，深化了對口腔健康和中性粒細胞活化狀態差異性的理解。利用顯微技術進行形態學觀察方便、快捷，但判斷過程存在主觀性，且NETs 網狀結構脆弱，增加了標本制作和保存的難度。此外，嗜酸性粒細胞、肥大細胞等免疫細胞受刺激后也會產生胞外誘捕網［12］。因此，形態學觀察只適合對NETs進行初步判斷，作簡單定性。

2 游離DNA/NETs組分檢測

在NETs 發現之前，游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的檢測早已在臨床上應用于診斷瀕危細胞或組織。cfDNA作為一種危險相關分子模式可以激活機體自身免疫應答反應，故cfDNA/NETs常用作評價機體感染程度的指標［13］。此外，隨著對cfDNA 構成NETs基本骨架的認識，檢測網狀結構形成過程中釋放的cfDNA可用于有效評價NETs。

2.1 電泳技術 按相對分子質量大小分離DNA 的凝膠電泳技術包括瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳2種方法，其能夠用于分離、鑒定和純化DNA 片段。cfDNA 是高度碎裂的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）片段，利用電泳雖不能排除其他方式產生dsDNA 的干擾，但血清中其他方式產生的dsDNA量所占比例較網狀結構形成過程中產生的量低，因此依然可有效鑒定核酸情況。國內有研究人員以PMA 誘導外周血中性粒細胞形成NETs，對樣品分別給予RNA 酶、DNA 酶處理、兩者兼有以及不處理，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳驗證核酸的形成，結果顯示網狀結構中的核酸為dsDNA；進一步采用熒光染色法測定DNA 含量，發現NETs 中的DNA 常以DNA-蛋白質復合物存在［14］。Yu等［15］采用非變性聚丙烯凝膠電泳分析尿路感染中樣本的活性蛋白質-DNA 復合物，分別用考馬斯亮藍G-250 測定蛋白質，溴化乙錠測定DNA，比較兩者顯色區域，結果證實在NETs 中富集DNA-蛋白質復合物，隨后用質譜技術驗證了這一觀點。電泳技術鑒定cfDNA 簡單、快速，能夠有效分解DNA 片段，其缺陷是不能確認cfDNA 是否完全來自于NETs，無法排除如組織損傷、細胞凋亡和壞死導致的其他cfDNA 的干擾，因此，電泳技術常在實驗室中用于定性分析NETs。

2.2 熒光染色法 利用特殊熒光染料與雙鏈DNA特異性結合，熒光分析儀在特定波長處檢測熒光強度，可定量分析cfDNA/NETs。傳統聚合酶鏈反應（PCR）技術通過凝膠電泳檢測擴增后的終點產物進行定量分析，其時間消耗和多個人為操作步驟導致該過程存在易污染、重復性差等缺點，這可能限制了NETs的檢測準確性，熒光PCR技術利用熒光信號采集系統實時監測整個量化進程，簡化操作流程，克服了傳統PCR 的缺點。隨著熒光顯微鏡的普及，免疫熒光標記的方法也日益應用廣泛，尤其是熒光雙標或多標法。在急性痛風性炎癥反應中，Mitroulis等［16］采用DNA 和MPO 雙重染色對痛風性關節炎模型滑液內的中性粒細胞進行共定位分析，在免疫熒光顯微鏡下觀察到了網狀結構（首次在痛風性關節炎中證實NETs），并提出白細胞介素-1β 參與了NETs 的形成。隨著急性痛風性關節炎炎癥反應自發消退機制的提出，Schauer 等［10］利用DNA 和NE 雙重染色免疫熒光圖像分析證實：在慢性痛風性關節炎中，NETs可通過降解趨化因子和細胞因子緩解炎癥反應。為克服單通道免疫熒光顯微分析存在的主觀性，Brinkmann等［17］采用雙通道熒光染色和自動圖像分割的方法來確定染色質解聚。該方法簡化了操作步驟，且利用染色強度對cfDNA進行量化，適用于簡單的顯微設備和借助微量滴定板的高通量篩選技術，但病原體DNA 會干擾熒光信號分割，導致偏差較大。Vong 等［18］在雙通道熒光染色基礎上利用DNA、NE和瓜氨酸化組蛋白（H3Cit）的疊加顯色，建立了三通道熒光免疫染色，該方法可用作量化和可視化NETs 的補充方法，但分析過程復雜，標記缺乏靈活性。此外，免疫熒光技術普遍存在熒光淬滅現象，因此樣品不能長期保存。由于抗體不純或交叉反應等原因，還可產生非特異性熒光干擾。Rebernick等［19］在免疫熒光分析法的基礎上，以類風濕性關節炎患者滑液中的NETs為研究對象，建立了DNA 面積與NETosis 分析法。它是一種基于Image J/Java程序的半自動量化網狀結構和DNA區域的方法，可解決分割多個細胞和消除細胞碎片所產生的限制問題，避免樣品間的偏差，降低個體差異。該法還具有易用性和靈活性等優點，可根據實驗室條件和細胞類型進行優化。

2.3 共聚焦顯微技術 在熒光顯微鏡成像的基礎上，共聚焦顯微技術以激光作為光源，紫外光或可見光激發熒光探針，再利用計算機進行圖像處理。采用共聚焦顯微鏡可在細胞、組織切片以及亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態的變化，它還可進行單色/多色熒光、z 軸采集、三維重構、時間序列成像和熒光強度測量等多種檢測［20］。研究表明NETs 中含有大量的內源性抗生素：陽離子抗菌肽LL-37，基于LL-37 的陽離子特性，可與網狀結構的DNA 結合，從而保護DNA不被核酸酶降解［21］。在利用熒光染料作為DNA 結合物檢測NETs 的分析方案中，染料與dsDNA 通過插層、靜電作用等方式結合而使熒光顯著增加，LL-37 與DNA 的結合，減弱了DNA 小片段（當dsDNA 用核酸酶處理時）與熒光染料的相互作用，導致熒光強度降低，從而阻礙熒光染色的可視化［22］。因此，以酶及其抗體為基礎的免疫熒光共定位技術是NETs可視化和定量分析的第一選擇［23］。石蠟切片能較好地保存組織結構，是常用的免疫組織化學常規制備切片方法之一。Brinkmann 等［24］采用石蠟包埋后的組織切片，使用未標記的初級抗體及特異性次級抗體的結合抗體，與宿主血清蛋白交叉吸收，避免了由于交叉標記而產生的假陽性染色。此外，該研究還比較了不同抗原提取方法和對不同抗體的檢測效果，結果顯示組蛋白H2B 抗體和H3Cit抗體在55°C孵育時均與致密或解聚染色體發生強烈結合，且染色效果最佳。Santos 等［25］在MPO與H3Cit 共定位的基礎上，采用共聚焦顯微鏡鑒定血栓樣本中的NETs 結構，證實了MPO 在NETs 形成過程中與NE 協同促進染色質解聚。這兩種蛋白質的共定位能較好地將NETosis 與其他細胞死亡形式區分開來，在NETs的鑒定中得到了廣泛應用。為進一步探究NETs 的信號調節通路，Desai 等［26］以MSU晶體誘導小鼠氣囊炎模型，進行NE、H3Cit 和DNA共染色，證實了受體相互作用蛋白激酶1/3和混合譜系激酶結構域樣蛋白參與MSU 晶體誘導的NETs 形成，且是信號通路中的重要分子靶點。隨后，Ginley等［27］設計了一種結合流式細胞術和細胞成像的方法，其基于使用共定位標記NETs 組分，通過設定閾值依次消除不符合條件的像素。這一方法可重復性較好，敏感度和特異度較高，但在不同疾病環境條件下對量化NETs的效果有待進一步證明。

共聚焦免疫熒光顯微鏡技術是一種重復性好，能對不同實驗室樣本結果進行比較，可直接研究NETs 固定樣品結構的有效方法。但免疫熒光共定位對圖像掃描參數有著嚴格的要求，且樣本制作要進行多重染色，步驟繁多，成本昂貴。

3 蛋白質組分檢測

MPO 和NE 等顆粒蛋白是組蛋白參與染色質去致密化過程最重要的蛋白酶，存在于中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中。此外，組蛋白翻譯后的修飾，如乙酰化、磷酸化和甲基化，可調節各種染色質功能，如染色質縮合/解聚，故H3Cit 作為網狀結構的生物標志物常用作NETs 的檢測指標［28］。因此，分析NETs中的典型蛋白質類組分可有效檢測NETs 的形成和相關的生理變化。

3.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 通過底物的顏色變化判定相關免疫反應的發生，顏色的深淺與標本中相應抗體或抗原含量呈正比，ELISA 以此達到定量分析。肽?；彼崦搧啺泵福╬eptidylarginine deaminase，PAD）4 在粒細胞中高度表達，通過介導H3Cit 參與NETs 形成。Th?lin 等［29］用脂多糖誘導缺血性腦卒中患者血漿樣品，以PAD4-H3Cit 為對照組，通過ELISA 法定量分析H3Cit 和游離瓜氨酸在450 nm 波長處的光密度值，其結果顯示游離瓜氨酸劑量對光密度值影響較低，兩者呈線性關系，排除了血漿中游離瓜氨酸對檢測結果的影響，由此建立了一種快速、可靠地檢測血漿中H3Cit 的方法。該研究還發現痛風石中通常存在多種蛋白質組分，如白細胞介素-1β、抗炎蛋白和促炎蛋白以及MPO 等酶類等。Sil 等［30］采用ELISA 法檢測痛風性關節炎中MPO 和NE 的表達情況，提出巨噬細胞受MSU 晶體刺激后通過分泌白細胞介素-1β促進NETs形成，隨后，激光共聚焦顯微鏡觀察結果證實了這一結論。研究人員在此基礎上設計了活細胞成像的熒光標記試驗，呈現了中性粒細胞釋放DNA 的動態過程，同時記錄了DNA 的結構變化［31］。ELISA 作為一種特異性檢測NETs 的方法，快捷方便，不需要特殊儀器設備，但受環境因素影響多，且仍存在非特異性免疫熒光的影響。

3.2 蛋白質印跡法 蛋白質印跡法又稱免疫印跡試驗，結合凝膠電泳和免疫性標記技術，通過分析特異性抗體對凝膠電泳處理過的樣品著色位置和深度，獲得特定蛋白質在樣品中的表達情況。Chatfield 等［32］利用此法對比MSU 晶體和PMA 誘導形成的NETs中蛋白質組分表達情況，結果顯示MSU晶體誘導產生的NETs中富含肌動蛋白，提出兩者通過不同途徑形成NETs，這一說法在臨床得以證實，患者痛風石中檢測到了富含肌動蛋白的晶體。NETs可能限制了痛風患者持續性炎癥反應的發展，這也符合臨床癥狀中炎癥自發消散現象［33］。炎癥小體作為激活痛風性炎癥發作的開關，其活化機制與細胞自噬有關［34］。在MSU 晶體刺激中性粒細胞一定時間后，采用蛋白質印跡法結合共聚焦顯微技術分析細胞自噬相關蛋白LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的變化情況，證實痛風中NETs的激活與白細胞介素-1β和細胞自噬信號通路有關［16］。PAD4 可加重炎癥性關節炎，是NETs形成的關鍵，PAD2對健康組織中的瓜氨酸化至關重要，但其在炎癥性關節炎和網狀結構中的作用尚不清楚。Bawadekar 等［35］分析小鼠類風濕性關節炎模型中的PAD2、PAD4 和免疫球蛋白G的表達水平，結果顯示PAD2 對腫瘤壞死因子-α 誘導的瓜氨酸化和關節炎炎癥有促進作用，但不是NETs 形成所必需。NETs 中含有高濃度、多種類的蛋白質組分，免疫印跡法可從分析蛋白組分方面解決網狀結構中的定性和定量問題，其應用范圍廣。但因樣品制備過程中易存在人為失誤，使定量分析結果偏差大，故常用作定性分析。

3.3 流式細胞術 基于DNA的熒光標記示蹤NETs敏感度低，而流式細胞術可通過檢測懸液中帶有標記的單細胞或細胞內顆粒物（如DNA、MPO、NE 等）熒光信號，從而實現高速、逐一的細胞定量分析。Masuda 等［36］基于流式細胞術，使用Sytox 染料對DNA 和MPO 共染色，鑒定了PMA 體外誘導中性粒細胞形成的纖維網狀結構，但此方法不能識別細胞質膜完全破裂的細胞，相比顯微成像分析數量有限，無法觀察到細胞形態、結構以及定位熒光信號到特定部位等缺陷。 多譜段成像流式細胞儀（multispectral imaging flow cytometry，MIFC）是綜合了熒光顯微鏡和流式細胞術的一種新型成像流式細胞儀，它可在多段波長同時捕獲高速、高分辨率的圖像，并進行大量懸浮細胞圖像的采集，精確量化NETs形成中的細胞核形態變化，兼具量化分析和成像 的 優 點。Zhao 等［37］利 用MIFC 檢 測DNA 染 色（Hoechst 染料）和MPO 的核位移，成功描述了NETs中細胞核的形態變化。以此為基礎，Carmona-Rivera等［38］在研究脂多糖誘導形成NETs過程中，進一步描述了DNA解聚和MPO的核易位過程，結果顯示在網狀結構形成過程中細胞核面積增加，熒光強度降低。利用MIFC 檢測NETs 具有清晰度高、敏感度高等優勢，此外，還可提供明場、暗場的熒光圖像、熒光強度和大量的細胞圖像定量數據。但該法具有一定局限性，其一，網狀結構形成期間的突出特征是核形態的變化，其直徑通過染色質的解聚而顯著增大，最終核物質幾乎完全占據細胞質。在此過程中，染料插入DNA的強度降低，此方法依賴于細胞核在NETs 形成早期的形態變化。因此應避免對中性粒細胞長時間的刺激。其二，MIFC檢測系統更注重于形變過程中的細胞，從而忽視已經溶解或處于形變后期的細胞。其三，在樣品制備過程中，離心等操作會造成細胞核的伸長或質膜的破裂，導致完整的細胞核從細胞中釋放，影響檢測結果。

4 結語

當前主要通過形態學觀察、游離DNA/NETs 和組蛋白、MPO、NE、細胞因子等蛋白質組分的量化分析對NETs進行評價，評價體系通常采用多種方法聯合分析。其中，蛋白質印跡法和ELISA 常用于輔助鑒定NETs，隨著顯微技術和免疫熒光新技術的發展，免疫熒光分析、共聚焦顯微技術、流式細胞術等方法在體外活細胞成像的運用使得纖維網狀結構的可視化程度大大提高。它們在量化NETs 方面應用廣泛，對網捕死亡及其他細胞死亡機制如凋亡或壞死的鑒別也最為可靠。目前，量化NETs的標準化實驗程序尚不完善，仍然缺少明確區分NETs與其他細胞死亡形式殘余物的鑒定標準。因此，更需要建立一種有效評價NETs的自動定量分析評價體系，這對深入探索不同疾病狀態的NETs 結構特征和生理病理機制尤為重要。