槐豬與杜洛克豬背部皮下脂肪轉錄組分析

葉鼎承 楊建敏 甘乾福 劉景

摘要 [目的]了解槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織脂肪沉積的分子機制差異。[方法]對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進行轉錄組測序，并進行生物信息學分析。[結果]槐豬和杜洛克豬分別獲得37 858 968和37 545 394條干凈讀段（clean reads）。槐豬和杜洛克豬分別預測到9 612和9 457可變剪接事件;兩豬種間共有709個差異表達基因，與杜洛克豬相比，槐豬有395個上調基因和314個下調基因。差異表達基因共歸類到46個GO條目中，其中細胞組分11個、分子功能12個及生物學過程23個;顯著富集的KEGG通路共計9個，其中含有與調節脂類代謝顯著相關通路，如胰島素信號通路和PPAR信號通路等。[結論]該研究可為今后研究脂肪沉積的遺傳機理提供科學依據。

關鍵詞 槐豬;杜洛克豬;背部皮下脂肪組織;差異表達;轉錄組測序

中圖分類號 S828;S813文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Transcriptome Analysis of Back Subcutaneous Fat of Huai Pig and Duroc Pig

YE Dingcheng1，YANG Jianmin2，GAN Qianfu3 et al （1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013;2.Animal Husbandry and Veterinary Station in Houyu Township of Changle District in Fuzhou City，Fuzhou，Fujian 350200;3.College of Animal Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002）

Abstract [Objective]To understand the molecular mechanism difference of fat deposition in the subcutaneous adipose tissue between Huai Pig and Duroc Pig.[Method]Transcriptome sequencing of subcutaneous adipose tissue in Huai Pig and Duroc Pig were performed and bioinformatic analysis was made.[Result]37 858 968 and 37 545 394 clean reads were obtained from Huai Pig and Duroc Pig ，respectively.9 612 and 9 457 alternative splicing events were predicted in Huai Pig and Duroc Pigrespectively. There were 709 differentially expressed genes （DEGs） in these two pig breeds.Compared with Duroc Pig，there were 395 upregulated genes and 314 downregulated genes in Huai Pig. The DEGs were classified into 46 gene ontology （GO） entries，including 11 cell components，12 molecular functions and 23 biological processes.A total of 9 pathways had enriched KEGG，which contained pathways significantly correlated with regulation of lipid metabolism，such as insulin signaling pathway and PPAR signaling pathway.[Conclusion]This study can provide scientific basis for the future study of the genetic mechanism of fat deposition.

Key words Huai Pig;Duroc Pig;Back subcutaneous adipose tissue;Differential expression;Transcriptome sequencing

脂肪沉積性狀是豬主要的經濟性狀之一，且與經濟價值緊密聯系。槐豬（Huai Pig）是福建省特色豬品種，早熟易肥，肉質優良，抗逆性強，但生長速度慢，瘦肉率低，是典型的脂肪型豬種，而西方現代豬種杜洛克豬（Duroc Pig）生長速度快，瘦肉率高，但肉質和抗逆性相對較差，是典型的瘦肉型豬種。為了解槐豬和杜洛克豬皮下脂肪組織脂肪沉積的分子機制差異，筆者對這兩個豬種背部皮下脂肪進行了轉錄組測序，并進行了生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與測序

選擇在相近飼養條件下同期飼養的190日齡槐豬和杜洛克豬各3頭，屠宰后分別取倒數第3～4根肋骨之間的背部皮下脂肪組織，置于液氮中貯存;采用TRIzol法提取各樣品的總RNA，并采用Nanodrop、Agilent 2100方法對RNA樣品的純度、濃度和完整性進行檢測，將符合測序要求的槐豬和杜洛克豬的總RNA分別等量混合，形成2個總RNA池，送交北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序（RNAseq）。

1.2 數據整理和分析

1.2.1 原始數據去雜。

測序所獲得的原始序列數據均帶有一段3′接頭序列，并且含有少量低質量序列以及各種雜質成分，經過數據處理得到可用的干凈讀段（clean reads）。 具體處理方法如下：去除3′接頭序列、去除空載讀長、去除低質量讀段（含有未知堿基N的讀段）、去除長度過小或過大的讀段等[1]。

1.2.2 序列比對和基因表達量分析。

使用TopHat軟件將獲得的干凈讀段（clean reads）與豬參考基因組（Sus scrofa 10.2：ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release75/fasta/sus_scrofa/）進行比對，并對比對效率進行統計[2]。采用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）作為衡量轉錄本或基因表達水平的指標[3]，FPKM計算公式如下：

FPKM=基因區的讀段數目×109基因長度×測序深度（1）

1.2.3 可變剪切預測。

使用Cufflinks軟件對基因原有的剪接模型進行比較，進行可變剪接事件（alternative splicing events）預測[3]。常見的可變剪接可分為6種類型：外顯子跳躍（exon skipping，ES）、內含子保留（intron retention，IR）、第一個外顯子可變剪接（alternative first exon，AFE）、最后一個外顯子可變剪接（alternative last exon，ALE）、5′端可變剪接（alternative 5′ splice site，A5SS）、3′端可變剪接（alternative 3′ splice site，A3SS）[4-5]。

1.2.4 基因功能注釋及差異表達基因篩選。

使用BLASTX軟件將基因序列與Nr、SwissProt、GO、COG和KEGG數據庫進行比對，獲得所有基因的注釋信息。使用R軟件的EBSeq包進行基因差異表達分析[6]，以=|log2（FC）|≥1且FDR<0.01作為篩選差異基因的標準。其中，差異倍數（fold change，FC）表示兩樣品之間表達量的比值，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）是對差異顯著性P值進行BenjaminiHochberg方法校正后得到的[7]。

1.2.5 GO功能分類。

使用Blast2GO軟件對差異表達基因進行GO功能分類，參數e值≤10-5[8]，并使用WEGO軟件進行統計并繪圖。GO（gene ontology）數據庫能對基因、蛋白質進行描述，其包含3個本體：細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物學過程（biological process）。

1.2.6 KEGG通路顯著性富集分析。

以KEGG通路為單位，找出與整個基因組背景相比在差異表達基因中顯著性富集的通路，其計算公式如下：

P=1-∑m-1i=0

Mi

N-Mn-i

Nn

（2）

式中，N為所有基因中具有通路注釋的基因數目;n為具有通路注釋基因中差異表達基因的數目;M為所有基因中注釋為某特定通路的基因數目;m為注釋為某特定通路的差異表達基因數目。Q≤0.05的通路定義為在差異表達基因中顯著富集的通路（Q表示錯誤比例，Q=V/R，其中R代表所挑選的差異基因個數，V代表沒有差異表達的基因個數，即假陽性結果）[1]。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量評估

對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進行轉錄組測序，獲得原始讀段數目分別為46 891 554和45 309 436條，原始讀段經過去雜處理后，獲得的干凈讀段數分別為37 858 968和37 545 394 條，其中78.54%和82.08% 的干凈讀段（clean reads）比對上豬參考基因組，可以滿足后續分析的需要。

2.2 可變剪切預測

槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織分別預測到9 612和9 457可變剪接事件。由圖1可知，在6個常見的可變剪切類型中外顯子跳躍的數量最多。

2.3 差異表達基因篩選和注釋

對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進行轉錄組測序，并進行差異表達基因篩選。結果發現，兩豬種共有709個差異表達基因，與杜洛克豬相比槐豬有395個上調基因和314個下調基因。各個數據庫注釋到的差異表達基因數目及所占比例如表1所示。

2.4 GO功能分類 由圖2可知，槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織的差異表達基因共歸類到46個GO條目中，其中細胞組分11個、分子功能12個及生物學過程23個。細胞組分中分類到較多基因的條目為cell part、cell和organelle，分別含540、540和394個基因;分子功能中的條目binding含450個基因;生物學過程中的條目cellular process、metabolic process和biological regulation分別含519、462和412個基因。

2.5 KEGG通路顯著性富集分析

槐豬和杜洛克豬背部皮

下脂肪組織之間的差異表達基因共顯著富集到9個KEGG通路，通路信息如表2所示。

3 討論

該研究對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進行轉錄組測序，分別獲得了37 858 968和37 545 394條干凈讀段。陳偉[9]對萊蕪豬和大白豬背最長肌的轉錄組測序分別獲得40 498 476 和59 072 892條干凈讀段。Sodhi等[10]對濟州島本地豬和巴克夏豬的脂肪組織進行了測序，分別獲得41 411 459 和40 308 452條干凈讀段。由此可見，對不同豬品種同一個組織測序所獲得的干凈讀段數目不同;對同一個豬品種的不同組織的測序所獲得的干凈讀段數目也不同，這可能是由于不同組織所行使的生理功能和所含的基因數目不同。

該研究在槐豬和杜洛克豬2個品種豬背部皮下脂肪中分別預測到9 612和9 457個可變剪切事件，其中外顯子跳躍的數量最多。Kang等[11]在研究不同年齡灘羊皮膚組織的可變剪切時，在1月齡皮膚組織發現有4 120個可變剪切，而在48月齡的皮膚組織中有4 237個可變剪切事件。李青芝等[12]在長白母豬背部皮下脂肪、大網膜脂肪和腸系膜脂肪的轉錄組研究中發現936～1 029個可變剪切事件。對基因組中可變剪切事件的預測，將有助于理解這些基因在轉錄調控機制方面的功能。

該研究對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織之間的差異表達基因進行GO功能分類和KEGG通路分析，有助于進一步了解差異表達基因的功能及基因產物在細胞代謝過程中的作用。KEGG通路反映蛋白質之間的互相作用關系，參與代謝通路的蛋白的表達量或者酶的活性改變都可以引起通路調節出現差異。該研究顯著富集的通路中，發現一些與調節脂類代謝顯著相關通路，如胰島素信號通路和PPAR信號通路等，為進一步研究脂肪沉積的分子機制提供了一定的參考，后期將結合蛋白質功能試驗（如基因敲除、轉基因和RNA干擾等）進一步證實。

參考文獻

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