葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍蛋白和藻紅蛋白的體外抗氧化活性比較研究

余佳，王生，許文琦，張瑞華，*，王玉蘭，*

（1.湖南炎帝生物工程有限公司湖南省微藻生物工程技術研究中心，湖南株洲412007；2.中國醫藥工業研究總院，上海醫藥工業研究院藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200437）

葛仙米（Nostoc sphaeroids），學名球狀念珠藻，屬藍藻門[1]（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc.）[2-6]，是一種藥食同源的經濟藍藻，在我國古代就有其食用和藥用的歷史記載，長期以來被作為有效的中草藥資源和膳食補充劑?！端幮钥肌分蟹Q葛仙米具有“清神解熱，痰火能療”的作用，《綱目拾遺》中則記載葛仙米具有“解熱，清膈，利腸胃”的作用，《陜西中草藥》稱其在“清熱收斂，益氣明目，治燙火傷，夜盲癥”有很好的功效[7]。野生葛仙米鮮品富含7%～8%的藻膽蛋白，主要為藻藍蛋白和藻紅蛋白，其中藻藍蛋白是藻紅蛋白的3.5 倍左右[8]；野生葛仙米干品的總蛋白含量高達50%以上，含有17 種氨基酸，其中8 種人體必需氨基酸含量達44.6%[9]。野生葛仙米較為罕見，早年主要分布在湖北鶴峰、湖南張家界等地區的農田中，但由于農藥的濫用，野生葛仙米大量減產，已瀕臨滅絕[10-11]。現在市場上主要為人工養殖的葛仙米，其干品蛋白質的含量不如野生葛仙米豐富，約在32%以上[12]。人工養殖的葛仙米已于2018 年被國家衛生健康委員會批復可作為新食品原料使用。

現代研究表明，葛仙米蛋白具有較好的調節免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外損傷、抗腫瘤等功能[13]。在抗氧化方面，周站平等研究發現藻膽蛋白具有較好的抗氧化作用，藻膽蛋白清除自由基主要是由藻膽色素完成，在光照和黑暗條件下，藻膽蛋白具有產生和清除自由基的雙重功能，而通過用十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脲及堿處理對藻膽蛋白進行變性，其產生自由基能力消失，清除自由基能力顯著增強[14]。陳德文采用化學發光法研究發現葛仙米藻紅蛋白對羥基自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基都有明顯的清除作用，表現出良好的抗氧化能力[15]。研究顯示葛仙米藻藍蛋白同樣具有抗氧化能力，體外研究顯示藻藍蛋白具有清除羥基自由基和過氧化氫自由基的能力，體內研究揭示藻藍蛋白可以抑制CCl4或 2，2-鹽酸脒基丙烷 （2，2'-azobis [2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）引起的肝臟線粒體脂質過氧化物的生成[16]。

已有研究人員對野生葛仙米藻膽蛋白、藻紅蛋白或藻藍蛋白的抗氧化作用進行了研究，但是，對由人工養殖的葛仙米提取純化得到的藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍蛋白抗氧化性能，以及這三者的活性對比研究鮮有報道。人工養殖的葛仙米蛋白是否也具有相類似的性能，不得而知。本研究前期通過微波輔助法[16]提取了人工養殖的葛仙米的藻膽蛋白粗提物，并將其純化得到藻藍蛋白和藻紅蛋白，并對這三者進行抗氧化活性對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用文獻[12]的方法制得的葛仙米藻膽蛋白粗提物母液、葛仙米藻紅蛋白母液（純度為95%）、葛仙米藻藍蛋白母液（純度為97%）：湖南炎帝生物工程有限公司自制。

鄰苯三酚：Sigma-Aldrich 公司；Tris-HCl 緩沖液（pH 8.8）：Solarbio 公司；2-硫代巴比妥酸、2-D-脫氧核糖、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、過氧化氫、苯甲酸、抗壞血酸及其他試劑：國藥集團。

1.2 儀器與設備

FORMA 371 STERI-CYCL 細胞二氧化碳培養箱、Varioskan Flash 酶標儀：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的配制

藻藍蛋白配制：藻藍蛋白母液最大濃度為4.94 mg/mL，依次用液（phosphate buffer saline，PBS）梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻紅蛋白配制：藻紅蛋白母液最大濃度為1.08 mg/mL，依次用 PBS 梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

藻膽蛋白粗提物配制：藻膽蛋白粗提物母液最大濃度為4.37 mg/mL，依次用磷酸緩沖鹽溶液PBS 梯度稀釋成 1、5、25、50、125、250、500、1 000 μg/mL。

1.3.2 清除羥基自由基能力測定

取8 支具塞試管，分別加入0.2 mL 10 mmol/L 的FeSO4-EDTA 混合液，0.2 mL 20 mmol/L 的 2-D-脫氧核糖溶液，0.2 mL 不同濃度受試樣品，并用PBS 補充至1.8 mL，最后加入 0.2 mL 10 mmol/L 的過氧化氫，37 ℃水浴加熱反應1 h，以苯甲酸（1 mg/mL）和抗壞血酸（1 mg/mL）為對照，加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥酸，混勻后沸水浴中加熱10 min，冷卻后離心取上清液，于532 nm 處測定吸光度。

羥基自由基的清除率/%=（A對照-A樣品）/A對照×100

1.3.3 清除超氧陰離子自由基能力測定

采用鄰苯三酚自氧化的方法進行清除超氧陰離子自由基能力的測定。

鄰苯三酚自氧化反應速度的測定：測定試驗在25 ℃下進行，向具塞試管中加入1.5 mL Tris-HCl-EDTA 緩沖液（pH 8.2）和 0.1 mL 6 mmol/L 的鄰苯三酚（對照組以10 mmol/L 鹽酸代替鄰苯三酚），用去離子水補足至3 mL，迅速混勻后，以對照管調零，在波長420 nm 處每0.5 min 測定一次吸光度，共測4 min，以吸光度和時間作圖，根據線性變化部分的斜率求出自氧化反應速度（ΔOD420/min）；適當改變鄰苯三酚的用量，使自氧化速度為0.02ΔOD420/min 左右。

受試蛋白對鄰苯三酚自氧化反應速度的影響：測定過程與鄰苯三酚自氧化相同，在反應體系中另加入0.1 mL 不同濃度的受試蛋白，適當調整樣品的濃度，使抑制下的氧化反應速度在0.007ΔOD420/min ～0.013ΔOD420/min。

超氧陰離子清除率/%=[自氧化（ΔOD420/min）-樣品管（ΔOD420/min）]/自氧化（ΔOD420/min）×100

1.3.4 對過氧化氫誘導的脂質過氧化的影響

取小鼠的肝組織，用冷生理鹽水洗凈后冰浴下勻漿，制成1%懸浮液。取1 mL 此懸浮液，0.1 mL 不同濃度樣品、0.1 mL 6 mmol/L FeS04、0.1 mL 60 mmol/L H2O2，對照組加0.1 mL 的PBS。37 ℃溫育1 h 后，加入1 mL 15%三氯乙酸終止反應，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸后，沸水浴15 min，流水冷卻，測定波長532 nm 處的吸光度。

抑制率/%=（對照孔吸光度-樣本空吸光度）/對照孔吸光度×100

1.4 統計方法

利用單因素方差分析對試驗數據進行統計分析，數據以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍蛋白對羥基自由基的清除能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍蛋白和藻紅蛋白對羥基自由基的清除能力見圖1。

圖1 不同濃度的3 種蛋白對羥基自由基的清除能力比較（n=3）Fig.1 Compare capability of scavenging hydroxyl radicals by three proteins at different concentrations（n=3）

在Fenton 體系羥基自由基清除能力試驗中，結果顯示藻紅蛋白、藻藍蛋白和藻膽蛋白粗提物都有較強的清除羥基自由基的能力，并且3 種蛋白都呈現出明顯的濃度依賴關系。藻紅蛋白在1 000 μg/mL時羥自由基清除率為（34.0±14.1）%，藻膽蛋白粗提物在1 000 μg/mL 時羥自由基清除率為（67.4±20.2）%，藻藍蛋白在1 000 μg/mL 時羥自由基清除率為（48.3±6.1）%，羥基自由基清除能力由強到弱依次為：藻膽蛋白粗提物>藻藍蛋白>藻紅蛋白。藻膽蛋白粗提物和藻藍蛋白羥基自由基清除能力明顯強于同濃度的苯甲酸和抗壞血酸。

2.2 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍蛋白和藻紅蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力見圖2和圖3。

圖2 鄰苯三酚自氧化速率與濃度之間關系Fig.2 Relationship between autooxidation rate and concentration of o-benzotriphenols

圖3 不同濃度的3 種蛋白對超氧陰離子清除能力比較（n=4）Fig.3 Capability of scavenging superoxide anions by three proteins at different concentrations（n=4）

通過鄰苯三酚自氧化條件摸索，設置鄰苯三酚濃度為34.4 mmol，此時對應的鄰苯三酚自氧化反應速度為0.02ΔOD420/min（見圖2），并以此條件進行后續的試驗考察。超氧陰離子清除能力檢測結果顯示藻紅蛋白、藻藍蛋白和藻膽蛋白粗提物都有一定的清除超氧陰離子的能力，并且三種蛋白都呈現出一定的濃度依賴關系（見圖3），藻紅蛋白在1000μg/mL 時超氧陰離子自由基清除率為（52.1±7.1）%，藻膽蛋白粗提物在1 000 μg/mL時超氧陰離子自由基清除率為（44.2±4.3）%，藻藍蛋白在1 000 μg/mL 時超氧陰離子自由基清除率為（50.5±11.9）%，超氧陰離子自由基清除能力由強到弱依次為：藻紅蛋白≥藻藍蛋白>藻膽蛋白。

2.3 藻膽蛋白粗提物、藻紅蛋白、藻藍蛋白抑制脂質過氧化的能力

不同濃度的葛仙米藻膽蛋白粗提物、藻藍蛋白和藻紅蛋白抑制脂質過氧化的能力見圖4。

圖4 不同濃度的3 種蛋白抑制脂質過氧化的能力（n=4）Fig.4 Capability of inhibit lipid peroxidation by three proteins at different concentrations（n=4）

結果顯示藻紅蛋白、藻藍蛋白和藻膽蛋白粗提物都有一定的抑制脂質過氧化的能力，并且三者都呈現出一定的濃度依賴關系，藻紅蛋白在1 000 μg/mL 時脂質過氧化抑制率為（47.4±4.7）%，藻膽蛋白粗提物在 1 000 μg/mL 時脂質過氧化抑制率為（28.8±4.9）%，藻藍蛋白在1 000 μg/mL 時脂質過氧化抑制率為（16.1±10.3）%，抑制脂質過氧化能力由強到弱依次為：藻紅蛋白>藻膽蛋白粗提物>藻藍蛋白。

3 結論與討論

自由基產生于機體內的許多氧化還原過程，它們由特定的酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等）捕獲或破壞。正常情況下，機體自由基的產生和清除維持一種動態平衡，一旦這個平衡被打破，過量的活性氧自由基會對機體造成傷害，如引起脂質過氧化而改變生物膜結構及功能，損傷DHA，使蛋白質變性及酶活力喪失等，這些危害直接或間接地導致了炎癥、衰老、心血管疾病及腫瘤的發生[17]。超氧陰離子自由基和羥基自由基是最具代表性的活性氧自由基，在機體的氧化反應中，超氧陰離子自由基通常最先形成，通過形成其他多種有破壞作用的自由基而使其功能放大。羥基自由基毒性最強，幾乎能與所有的功能性生物大分子反應，造成生物體的巨大傷害[18]。

本文采用Fenton 體系進行清除羥基自由基能力測定，采用鄰苯三酚自氧化的方法進行清除超氧陰離子自由基能力的測定，并通過過氧化氫誘導脂質過氧化，測定蛋白對其的抑制作用。試驗結果顯示藻膽蛋白、藻紅蛋白和藻藍蛋白都有明顯的抗氧化作用，但作用方式和抗氧化程度有所不同。在羥基自由基清除試驗中，抗氧化活性由強到弱依次為藻膽蛋白粗提物＞藻藍蛋白＞藻紅蛋白；在超氧陰離子自由基清除試驗中為藻紅蛋白≧藻藍蛋白＞藻膽蛋白粗提物；在抑制脂質過氧化試驗中為藻紅蛋白＞藻膽蛋白粗提物＞藻藍蛋白。

葛仙米藻紅蛋白和藻藍蛋白雖然由葛仙米藻膽蛋白分離純化得到，但是，在羥基自由基清除試驗中藻膽蛋白粗提物的活性明顯優于藻紅蛋白和藻藍蛋白，這可能是由藻膽蛋白粗提物中其他多糖或酚類物質共同作用的結果。而在超氧陰離子自由基清除試驗和抑制脂質過氧化試驗中，藻紅蛋白的能力最強。在這3 個抗氧化能力試驗中，藻紅蛋白的能力均強于藻藍蛋白，這可能是由于藻紅蛋白的結構上含有比藻藍蛋白更多的還原型殘基，因此，其具有更強的抗氧化性能，而具體機理還有待進一步研究。