南瓜均一多糖的分離純化及其抗氧化活性的研究

吳艷麗，邵珠領，張宇，*，王宇亮，趙芷萌

（1.佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯154007；2.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，黑龍江哈爾濱150070）

南瓜（Cucurbita moschata Duch），又被稱為番瓜、倭瓜、金瓜等，屬于葫蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，明代時期傳入中國，現在我國各地廣泛種植。南瓜亦可代糧食，又可供藥用，是傳統的藥食兩用植物，現代研究表明南瓜不僅富含氨基酸、維生素、蛋白質及淀粉等功能性成分，而且含有多種人體所需的鋅、鐵、硒等微量元素[1-3]，其中南瓜多糖是南瓜中重要的活性成分之一，具有較高的醫藥保健作用。

南瓜多糖作為一種天然提取產物，不僅具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調節等多種生物活性，而且無毒副作用，有著廣泛的開發前景[4-5]。王艷玲等[6]以水為提取溶液，采用正交設計試驗的方法，確定了微波輔助提取南瓜多糖的最佳工藝。王傳棟等[7]通過動物和細胞實驗研究發現，南瓜多糖不僅具有抑制腫瘤生長的作用，還可提高紅細胞的免疫吸附功能。目前對南瓜多糖的研究主要集中在優化南瓜多糖的提取工藝、探究多糖對高血糖高血脂的輔助治療及其作用機制、延緩和控制腫瘤生長、增強細胞免疫功能等方面[8-11]，盡管已有對南瓜多糖抗氧化活性的報道[12]，但并未就其構效關系進行更深入的研究，特別是對南瓜均一多糖的抗氧化活性與其結構之間的關系研究較少。

因此，本試驗以新鮮南瓜為原材料，通過提取、分離純化得到5 種均一多糖，通過測定其分子量、單糖組成，研究其與抗氧化活性之間的關系，為南瓜多糖抗氧化活性構效關系的研究提供科學依據，并對新型天然抗氧化劑的開發利用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮成熟南瓜：黑龍江省佳木斯市農貿市場，經佳木斯大學藥物化學教研室張宇教授鑒定為葫蘆科南瓜；AB-8 大孔吸附樹脂：東鴻化工有限公司；DEAE Cellulose-52 纖維素：英國 Whatman 公司；Sephadex G-100 葡聚糖凝膠：美國GE Healthcare 公司；單糖標準品：中國食品藥品檢定研究院；右旋糖苷葡聚糖標準品、DPPH：美國 Sigma 公司；抗壞血酸（VC）：南京建成生物工程研究所；三蒸水：佳木斯大學藥學院實驗室自制。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004 型分析天平：上海恒平儀器有限公司；UV757 型紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HH-2 電熱恒溫水浴鍋：余姚市遠東數控儀器廠；LC-5510 高效液相色譜儀配備紫外檢測器：北京東西分析儀器有限公司；UM4800 蒸發光散射檢測器：上海通微分析技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南瓜預處理

將新鮮成熟南瓜洗凈，去皮、去瓤、去籽，切成薄片后置于70 ℃烘箱中，12 h 后取出粉碎，過60 目篩，采用索氏提取法將粉碎后的南瓜粉用適量的95%乙醇80 ℃加熱回流提取4 h，提取液過濾，濾渣于60 ℃烘箱中過夜干燥，得到預處理后的南瓜粉，裝于自封袋內，放于干燥器中備用。

1.3.2 南瓜多糖的提取

稱取一定量預處理后的南瓜粉，加入10 倍體積的蒸餾水，混合均勻后，在70 ℃、200 W 的超聲波下提取30 min，提取液過濾離心棄去沉淀，上清液減壓濃縮，加入95 %乙醇，使乙醇體積分數達到80 %，攪拌均勻后于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心（25℃，4 000 r/min，10 min）收集沉淀，沉淀加適量蒸餾水復溶后，再次減壓濃縮，真空冷凍干燥24 h，即得南瓜粗多糖。按以下公式計算南瓜粗多糖得率。

式中：m 為南瓜粗多糖質量，g；M 為預處理后南瓜粉質量，g。

取50 g 南瓜粗多糖配成10%的多糖溶液，采用Sevag 法脫蛋白[13]，重復操作6 次，合并多糖溶液減壓濃縮至一定體積流水透析48 h，透析袋內液體減壓濃縮后真空冷凍干燥24 h，既得除蛋白后的南瓜多糖。稱5 g 脫蛋白后的多糖溶于100 mL 三蒸水中，25 ℃條件下4 000 r/min 離心10 min 后取上清液在已準備好的AB-8 大孔樹脂柱上進行上樣，吸附24 h 后用三蒸水進行洗脫，采用α-萘酚-硫酸法進行終點檢測，合并洗脫液，減壓濃縮、透析、冷凍干燥，即得脫色除雜后的南瓜多糖（Cucurbita moschata Duch polysaccharide，CMP）[14]。

1.3.3 南瓜多糖的分離純化

取 2 g CMP 溶于 100 mL 三蒸水中，離心（25 ℃，4 000 r/min，10 min）后取上清液在已備好的DEAE Cellulose-52 色譜柱上進行分離，吸附12 h 后分別用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的 NaCl 溶液進行洗脫，用自動接樣器收集洗脫液，流速為1 mL/min，5 mL/管，采用苯酚-硫酸法測定紫外吸光度值（490 nm），繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線分段合并，減壓濃縮后蒸餾水透析48 h，透析袋內液體濃縮、冷凍干燥[15]。

分別稱取經DEAE Cellulose-52 色譜柱分離得到的各組分0.3 g，溶于50 mL 蒸餾水中，離心后取上清液沿壁上樣于已備好的Sephadex G-100 色譜柱，吸附12 h 后用三蒸水洗脫，流速為0.5 mL/min，5 mL/管，采用苯酚-硫酸法隔管測490 nm 處的紫外吸光度值，繪制洗脫曲線，合并單一組分，減壓濃縮后蒸餾水透析48 h，冷凍干燥[16]。

1.3.4 南瓜多糖純度檢驗及分子量測定

色譜條件：儀器：LC5510 高效液相色譜儀；檢測器：UM4800 蒸發光檢測器；色譜柱：Waters UltrahydrogelTM水溶性凝膠柱（7.8×300 mm）；流動相：三蒸水；流速：0.8 mL/min；漂移管溫度：40 ℃；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

分別精密稱取10 mg 不同分子量（5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、150 000 Da 和 270 000 Da）的右旋糖酐葡聚糖標準品，加三蒸水定容于5 mL 容量瓶中，配置成濃度為2 mg/mL 的標準品溶液，過0.45 μm的水相微孔濾膜，取10 μL 按上述色譜條件進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，以色譜峰的保留時間（T）為橫坐標，以標準品的分子量對數值（logMw）為縱坐標，得線性回歸方程。分別稱取10 mg 經Sephadex G-100 凝膠柱色譜純化得到的 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1 及CMP-D2 5 個組分，配制成2 mg/mL 的多糖樣品溶液，按上述方法操作，檢驗其純度，并記錄得到單一對稱峰的保留時間，將其代入回歸方程，即得南瓜多糖的相對分子質量Mw。

1.3.5 南瓜均一多糖的單糖組成分析

色譜條件為LC5510 高效液相色譜儀，色譜柱：ODS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.7 mL/min；流動相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液-乙腈 83 ∶17（體積比）；柱溫：30 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254 nm。

取單糖對照品（甘露糖Man、鼠李糖Rha、葡萄糖醛酸GlcA、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara、巖藻糖Fuc）用三蒸水配制成濃度為40 mmol/L 的標準品單糖混合溶液。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1，2-dihydropyrazol-3-one ，PMP）柱前衍生法[17]，取標準單糖混合液1 mL 與0.5 mL 0.3 mol/L 的NaOH 溶液和0.5 mL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液渦旋混勻；于70 ℃水浴中反應 1 h，取出冷卻至25 ℃，加0.5 mL 0.3 mol/L 的 HCL溶液終止反應，加2 mL 三氯甲烷萃取3 次，棄氯仿層。水相過0.45 μm 微孔濾膜后，取10 μL 按上述色譜條件進行HPLC 分析，并將水相稀釋成7 種不同摩爾濃度（35、30、25、20、15、10、5 mmol/L） 的標準品混合溶液，進行HPLC 分析，以峰面積為縱坐標，摩爾濃度為橫坐標進行線性分析，得回歸方程。

分別取10 mg 南瓜均一多糖于安瓿瓶中，加4 mol/L 的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）4 mL，溶解后密封，121 ℃水解2 h，冷卻至25 ℃后加入甲醇溶液反復洗滌旋干以除去多余的TFA，加入1.5 mL 三蒸水使其溶解，離心取上清液，然后按上述PMP 法柱前衍生后進行HPLC 分析。

1.3.6 體外抗氧化活性研究

1.3.6.1 南瓜均一多糖對DPPH 自由基的清除作用

取2 mL 不同濃度的南瓜均一多糖溶液于具塞試管中，加入0.2 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液2 mL，以蒸餾水作空白試驗，并以相同濃度的VC溶液作為陽性對照，25 ℃避光反應30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值，平行3 次試驗取平均值[18]。南瓜均一多糖對DPPH自由基的清除率按式（1）計算。

式中：A1為多糖溶液+DPPH 溶液的吸光度值；A2為多糖溶液+無水乙醇的吸光度值；A0為蒸餾水+DPPH 溶液的吸光度值。

1.3.6.2 南瓜均一多糖對羥基自由基的清除作用

參照黃瓊等[19]的水楊酸比色法并改進，取1 mL 不同濃度的南瓜均一多糖溶液于10 mL 試管中，加入0.5 mL 9 mmol/L 的 FeSO4溶液和 0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，最后加入0.5 mL 8.8 mmol/L 的H2O2試劑啟動反應，振蕩混勻后置于37 ℃的水浴中反應30 min，冷卻至25 ℃，空白組以同等體積的蒸餾水代替樣品液測定吸光值，以VC為陽性對照，在510 nm 處測定吸光值，每個樣品重復3次試驗取平均值。羥基自由基的清除率按式（2）計算。

式中：A1為多糖+水楊酸-乙醇+FeSO4+H2O2的吸光度值；A2為多糖+水楊酸-乙醇+蒸餾水+H2O2的吸光度值；A0為蒸餾水+水楊酸-乙醇+FeSO4+H2O2的吸光度值。

1.3.7 數據分析

所得試驗數據采用SPSS 21.0 進行統計學分析，多組間比較采用方差分析，p＜0.05 表示差異顯著，具有統計學意義；p＜0.01 表示差異極顯著，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 南瓜多糖的提取分離及純化結果

2.1.1 南瓜多糖的提取結果

以新鮮南瓜為原材料，采用超聲波輔助提取法一共提取3 kg 預處理后的南瓜粉，共得到347.62 g 南瓜粗多糖，得率為11.59%。

2.1.2 DEAE Cellulose-52 纖維素柱色譜分離結果

南瓜多糖（CMP）經DEAE Cellulose-52 纖維素柱色譜進行分離，采用不同濃度的NaCl 溶液進行洗脫，得到以洗脫管數-吸光度值繪制的洗脫曲線，見圖1。

圖1 DEAE Cellulose-52 色譜柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of pumpkin polysaccharide polysaccharides by DEAE Cellulose-52

根據洗脫曲線進行分段合并，每段減壓濃縮，透析，冷凍干燥，得到6 個組分，分別命名為Fr.a1、Fr.a2、Fr.b、Fr.c、Fr.d、Fr.e。

2.1.3 SephadexG-100 凝膠柱色譜純化結果

選擇主要組分 Fr.a1、Fr.a2、Fr.b、Fr.c、Fr.d 過Sephadex G-100 凝膠柱色譜進一步分離純化，得到7個組分，洗脫曲線如圖2 所示。

圖2 SephadexG-100 凝膠柱色譜洗脫曲線Fig.2 Elution curve of pumpkin polysaccharide polysaccharides by SephadexG-100

分段合并單一的對稱峰，各部分濃縮、透析、冷凍干燥，分別命名為 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMPC1、CMP-C2、CMP-D1、CMP-D2，本文選擇含量較大的5 個組分 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMPD2 為進一步研究對象。

2.2 多糖純度檢驗及分子量測定結果

南瓜均一多糖高效液相色譜圖見圖3。

圖3 南瓜均一多糖高效液相色譜圖Fig.3 HPGPC chromatograms of pumpkin homogeneous polysaccharide

采用HPLC 法測得經AB-8 大孔吸附樹脂柱、DEAE Cellulose-52 纖維素柱和Sephadex G-100 凝膠柱色譜分離純化得到的CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 5 種南瓜多糖均呈現單一的對稱峰，且無雜質峰，可證明其為均一多糖（見圖3b～圖3f）。由HPLC 法測得右旋糖苷葡聚糖標準曲線為logMw=-0.938 1T+12.497 6，R2=0.998 6（見圖 3a）。將各樣品保留時間代入回歸方程得其分子量大小，見表1。

由表1 可知南瓜均一多糖的分子量范圍較大，在幾千到幾百萬之間，其大小依次為CMP-A2＞CMP-B＞CMP-C1＞CMP-A1＞CMP-D2。

表1 南瓜均一多糖的保留時間和分子量Table 1 Retention time and molecular weight of pumpkin homogeneous polysaccharide

2.3 多糖的單糖組成測定結果

南瓜均一多糖樣品單糖組成的HPLC 圖見圖4。

圖4 南瓜均一多糖樣品單糖組成的HPLC 圖Fig.4 The HPLC chromatograms of component monosaccharides of pumpkin homogeneous polysaccharide

混合標準單糖經PMP 柱前衍生后進行HPLC 分析，可得到9 種單糖的保留時間和峰面積（見圖4a），并對其進行定量分析。CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1 及CMP-D2 5 種南瓜均一多糖經TFA 水解并衍生后，進行 HPLC 測定（見圖 4b～4f），將 5 種南瓜均一多糖的HPLC 色譜圖與混合單糖標準品的HPLC 色譜圖進行對照，可知，CMP-A1 由 Rha、Glc、Gal、Ara 組成，其摩爾比為 5.36 ∶47.51 ∶1.05 ∶1.00，不含糖醛酸；CMP-A2 由 GlcA、Glc、Gal、Ara 組成，其摩爾比為1.00 ∶2.93 ∶2.51 ∶1.96，糖醛酸所占摩爾比例為 11.90%；CMP-B 由 Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為 4.78 ∶1.67 ∶1.00 ∶9.81 ∶6.78 ∶17.96 ∶13.63 ∶8.22，糖醛酸所占摩爾比例為 16.93%；CMP-C1由 Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為 2.79 ∶2.31 ∶1.00 ∶8.52 ∶4.18 ∶4.64 ∶3.79 ∶7.16，糖醛酸所占摩爾比例為27.67 %；CMP-D2 由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fuc 組成，其摩爾比為4.89 ∶5.97 ∶1.00 ∶6.23 ∶5.68 ∶9.76 ∶4.85 ∶5.42，糖醛酸所占摩爾比例為16.51%。比較5 種南瓜均一多糖的糖醛酸含量，其大小依次為CMP-C1＞CMP-B＞CMPD2＞CMP-A2＞CMP-A1。

2.4 南瓜均一多糖體外抗氧化活性測定結果

2.4.1 多糖對DPPH 自由基清除作用的測定結果

南瓜均一多糖對DPPH 自由基的清除作用見圖5。

圖5 南瓜均一多糖對DPPH 自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of pumpkin homogeneous polysaccharide

通過測定517 nm 波長處的吸光度并計算，由圖5可知，5 種南瓜均一多糖對DPPH 自由基均有一定的清除作用，且隨著質量濃度的增大其清除率逐漸增強，當多糖濃度為 4 mg/mL 時，CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及 VC對 DPPH 自由基的清除率分別為（41.45±1.57）%、（50.89±1.21）%、（58.73±1.02）%、（68.94±1.59）%、（59.78±2.03）%、（80.21±1.97）%。通過方差分析，可知CMP-B 和CMP-D2 對DPPH 自由基的清除作用具有差異性，但差異不明顯，無統計學意義（p＞0.05），其他各組兩兩相比，對DPPH自由基的清除作用均有極顯著性差異（p＜0.01）。通過曲線擬合函數，計算得到 CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及 VC對 DPPH 自由基的半抑制濃度（IC50）分別為（3.74±0.05）、（2.61±0.12）、（1.78±0.03）、（2.45±0.08）、（0.93±0.02）mg/mL，CMP-A1 對 DPPH 自由基的清除率較低，在試驗濃度范圍內未達到IC50，通過比較IC50的大小可知，5 種南瓜均一多糖及VC對DPPH 自由基清除能力的強弱依次為：VC＞CMP-C1＞CMP-D2＞CMP-B＞CMP-A2＞CMP-A1。CMP-C1 與 CMP-B 相比，兩者的分子量比較接近，CMP-C1 的糖醛酸含量遠遠大于CMP-B 的糖醛酸含量，CMP-C1 對DPPH 自由基的清除率比CMP-B 高出10.21%；CMP-D2 與CMP-B相比，兩者糖醛酸含量相近，CMP-D2 的分子量顯著小于CMP-B 的分子量，但CMP-D2 對DPPH 自由基的清除率僅比CMP-B 高出1.05%。以上結果表明，南瓜多糖的糖醛酸含量對DPPH 自由基的清除作用影響較大，糖醛酸含量越高，其抗氧化活性越大；而分子量大小對其影響較小。

2.4.2 多糖對羥基自由基清除作用的測定

南瓜均一多糖對羥基自由基的清除作用見圖6。

圖6 南瓜均一多糖對羥基自由基的清除作用Fig.6 ·OH radical scavenging activities of pumpkin homogeneous polysaccharide

由圖6 可知，5 種南瓜均一多糖對羥基自由基均具有較強的清除能力，且呈劑量依存關系，多糖質量濃度越大，對羥基自由基的清除率越強。當多糖濃度為 4 mg/mL 時，CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 及VC對羥基自由基的清除率分別為（56.78±2.16）%，（63.52±1.97）%，（71.32±1.71）%，（82.35±1.68）%，（73.28±1.03）%，（95.04±2.25）%。方差分析結果表明，CMP-B 和CMP-D2 對羥基自由基的清除作用具有顯著性差異（p＜0.05），其他各組兩兩相比，對羥基自由基的清除作用均具有極顯著性差異（p＜0.01）。擬合曲線方程，計算得 CMP-A1、CMP-A2、CMP-B、CMPC1、CMP-D2 及 VC對羥基自由基的 IC50分別為（3.32±0.14）mg/mL、（2.73±0.12）mg/mL、（2.01±0.08）mg/mL、（0.87 ±0.05） mg/mL、（1.68 ±0.09） mg/mL、（0.13 ±0.02）mg/mL，由 IC50可知，5 種南瓜均一多糖及 VC對羥基自由基的清除能力，由強到弱依次為：VC＞CMPC1＞CMP-D2＞CMP-B＞CMP-A2＞CMP-A1。CMP-C1 與CMP-B 相比，兩者的分子量大小相近，CMP-C1 的糖醛酸含量明顯高于CMP-B，CMP-C1 對羥基自由基的清除率比CMP-B 高出 11.03 %；CMP-D2 與 CMP-B相比，兩者的糖醛酸含量基本相等，CMP-D2 的分子量明顯小于CMP-B，但CMP-D2 對羥基自由基的清除率僅比CMP-B 高出1.96%。以上結果表明，多糖的糖醛酸含量對羥基自由基的清除作用影響較大，而分子量大小對其影響較小。

3 結論

采用超聲輔助法提取南瓜多糖，其粗多糖得率為11.59%，脫蛋白脫色后，經纖維素DEAE Cellulose-52及凝膠Sephadex G-100 柱色譜分離純化得到CMPA1、CMP-A2、CMP-B、CMP-C1、CMP-D2 5 種多糖組分，采用高效液相色譜法鑒定為南瓜均一多糖，其分子量分別為（5.37×104）、（1.11×106）、（2.38×105）、（2.05×105）、（2.10×103）Da，糖醛酸所占摩爾比例分別為 0%、11.90%、16.93%、27.67%、16.51%。通過 DPPH 法和水楊酸比色法檢測南瓜均一多糖的抗氧化活性，結果表明，5 種南瓜均一多糖在（0.5～4.0）mg/mL 濃度范圍內對DPPH 及羥基自由基均有不同程度的清除作用，其清除率隨質量濃度的增大而增大。

通過分析5 種南瓜均一多糖抗氧化活性與其分子量大小、糖醛酸含量之間的關系發現：多糖的糖醛酸含量對其抗氧化活性影響較大，糖醛酸含量越高，其抗氧化活性越強，其作用機制可能是由于多糖中的糖醛酸基團可以激活異頭碳上的氫原子，提高氫原子的供給能力，從而引起更強的抗氧化活性[20]。而分子量大小對其抗氧化活性的影響較小，相比高分子量的多糖，低分子量的多糖抗氧化活性更強一些，可能是由于低分子量的多糖糖鏈較短，結構比較簡單，更易暴露出游離的羥基基團，羥基基團有利于自由基的清除，從而提高多糖的抗氧化活性[21]。該結果可為南瓜多糖構效關系的研究提供相關參考依據，為天然抗氧化產品的原料篩選及其開發利用提供新方向。