響應面法優化鼠李果實多糖提取工藝

周巍，趙彥鵬

(信陽農林學院 農學院，河南 信陽464000)

鼠李(RhamnusdavuricaPall)，鼠李科鼠李屬植物，落葉小喬木或灌木，生于山坡林下，在我國分布廣泛，河南、山西、吉林等省均有分布[1]。鼠李有重要的藥用價值，它可用于清熱利濕、消積通便等癥狀。研究表明[2]，鼠李果實中含有大黃素、大黃酚、萜類化合物、有機酸、多糖類等多種物質。多糖是一種重要的生命活性物質，多糖因具有優良的抗自由基功能以及抗腫瘤作用[3]，在食用和醫學方面具有廣泛應用。多糖也是很好的免疫增強劑，該特性對新型醫藥產品的研發提供了思路[4]。但迄今為止，國內外對鼠李果實多糖的研究還未見報道，因此，本研究通過響應面法優化鼠李果實多糖的提取工藝，以期對鼠李果實多糖資源的進一步開發利用提供了理論和實踐參考[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：鼠李果實，產地河南，采自河南省信陽市金牛山。選取干燥果實，用粉碎機完全粉碎后過100目篩，備用。試劑：5 %苯酚(現配現用)，丙酮、乙醚、葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

表1 使用的主要儀器

1.3 試驗方法

1.3.1 鼠李果實粗多糖提取工藝流程 鼠李果實粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加4倍無水乙醇→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥→鼠李果實粗多糖。

1.3.2 標準曲線的繪制 用電子分析天平準確稱取葡萄糖(預先在105 ℃下經干燥至恒重)2.5000 g于500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，室溫下放置30 min，待充分溶解后移取2 mL，定容于100 mL容量瓶中。得濃度為100μg/mL的葡萄糖標準溶液。分別用移液管移取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL的標準溶液于20 mL具塞試管中，加水至2 mL，搖勻，然后加入1mL體積分數5 %苯酚，搖勻后，加入5 mL濃硫酸，振蕩搖勻后放于試管架上，室溫下放置15 min左右。以2 mL蒸餾水為空白對照，在波長490 nm條件下測定溶液的吸光度[6]。作濃度-吸光度曲線圖，如圖1。通過回歸分析得到線性回歸函數為：Y=0.0124S+0.1577，R2=0.9963。

圖1葡萄糖標準曲線

1.3.3 多糖的測定 多糖測定采用苯酚-硫酸法[7]。由圖1可知濃度-吸光度的函數方程為：Y=0.0124S+0.1577，R2=0.9963，Y為吸光度/(A), S為葡萄糖濃度/(μg/mL)。鼠李果實多糖提取率計算公式如下：

1.3.4 單因素試驗 液料比對多糖提取率的影響：準確稱取1.0000 g鼠李果實粉末，設置梯度液料比為45:1、50:1、55:1、60:1、65:1(mL/g)，水浴時間設定為1.5 h，水浴溫度設定為80 ℃，在恒溫水域鍋中提取，冷卻離心(3000 r/min)，取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min，測定溶液吸光度值。

提取溫度對多糖提取率的影響：準確稱取1.0000 g鼠李果實粉末，加入55 mL蒸餾水，水浴時間設定為1.5 h，提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃, 在恒溫水域鍋中進行提取，冷卻離心(3000 r/min)。取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min,測定溶液吸光度值。

提取時間對多糖提取率的影響：準確稱取1.0000 g鼠李果實粉末，加入55 mL蒸餾水，設置提取溫度80 ℃，設置梯度提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，在恒溫水域鍋中進行提取，冷卻離心(3000 r/min)。取2 mL上清液于15 mL具塞管中，加1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，室溫下放置15 min, 測定溶液吸光度值。

1.3.5 響應面實驗 結合單因素實驗數據，設計三因素優化鼠李果實多糖提取率的響應面實驗。利用Design-Expert軟件，根據Box-Benhnken實驗設計原理，建立多元二次回歸模型方程，用多項式對本實驗中三個因素與指標的相互關系進行近似擬合，通過對回歸函數的分析及各因素相互作用的響應面圖形分析來尋求最佳工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對鼠李果實多糖提取率的影響 由圖2可知，在液料比較小時考慮到多糖未能充分溶解，所以多糖提取率隨液料比的增大而逐漸增加，在液料比達到55:1時，再增加液料比時多糖的提取率變化不大，不再有明顯的波動情況。因此在考慮成本的情況下取液料比55:1為最佳條件。

圖2液料比對鼠李果實多糖提取率的影響 圖3提取溫度對鼠李果實多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度對鼠李果實多糖提取率的影響 如圖3可知，在設定條件范圍內，隨著提取溫度的升高多糖提取率逐漸提高，在溫度達到70 ℃時提取率達到峰值，之后增加溫度多糖提取率逐漸下降，可能是過高的溫度導致多糖降解。因此，最佳溫度條件設定為70 ℃。

圖4提取時間對鼠李果實多糖提取率的影響

2.1.3 提取時間對鼠李果實多糖提取率的影響 如圖4可知，當提取時間達到1.5 h時，鼠李果實多糖提取率達到最大值。在低于1.5 h時多糖提取率隨著提取時間的增加逐漸提高，在高于1.5 h時多糖提取率逐漸下降，可能是過長的時間導致多糖分解。因此，最佳提取時間選取1.5 h。

2.2 響應面試驗

2.2.1 分析因素的選擇及分析方案 根據單因素實驗結果確定以下三個因素的三個不同編碼水水平進行鼠李果實多糖提取工藝響應面優化設計方案[8]，如表2所示。

表2 響應面分析因素與水平表

實驗方案及結果如表3所示。

表3 實驗方案及實驗結果

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗 使用Design-Expert8.0.6軟件對表3中鼠李果實多糖提取率進行多元回歸擬合，得到回歸方程：

Y=1.11+0.098·A-1.625·10-3·B-2.500·10-3·C-2.250·10-3·AB+3.500·10-3AC-4.500·10-3·BC-0.10·A2-0.10·B2-0.10·C2；方程反映了提取時間、液料比、提取溫度與提取率的關系。

2.2.3 響應面回歸模型的方差分析 對鼠李果實多糖提取率的回歸模型進行方差分析，結果如表4。

從表4可知，模型P<0.001<0.01,方程回歸極顯著；該回歸方程相關系數R2=0.9993，又因為該模型的失擬項P=0.0997>0.05，說明模型擬合度高，可以用來描述鼠李果實多糖提取率與其影響因素之間的關系，該試驗方法可靠[9]。另外，FA>FC>FB,說明液料比對鼠李果實多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，提取時間影響最小。

表4 方差分析

注：**為及其顯著(P<0.01);*為顯著(0.01

2.2.4 多糖提取率的響應面分析 由表4可知，模型中一次項A的P<0.0001, 說明差異極顯著；一次項B的P>0.05, 差異不顯著。FA>FB表明液料比比提取時間對鼠李果實多糖的提取率影響更大。

由圖6可知，存在液料比和提取溫度的最佳組合，但液料比的變化趨勢比提取溫度的變化趨勢顯著，這顯示液料比對鼠李果實多糖提取率的影響更大。

圖5Y=f(A,B)的響應面 圖6Y=(A,C)的響應面 圖7Y=(B,C)的響應面

圖7表明，提取溫度和提取時間所構成的響應面圖形有最高點，兩因素交互作用顯著，所以二者存在最優組合[9-10]；另外曲面的變化趨勢也十分相似，但提取溫度比提取時間略微陡峭一點，因此提取溫度對鼠李果實多糖提取率的影響更大些。

圖5、圖6、圖7直觀地反映了液料比、提取溫度、提取時間三個因素的交互作用對響應值的影響，綜合分析可以看出提取時間和提取溫度(BC)交互作用曲面的坡度最陡峭，表明其對鼠李果實多糖提取率的交互作用最明顯。

2.2.5 最佳工藝條件的優化 利用Design-Expert8.0.6軟件進行數據優化，鼠李果實多糖提取的最佳工藝組合為：液料比為53:1，提取時間為1.5 h，提取溫度為69.80 ℃，考慮到實際試驗的可操作性，鼠李果實多糖提取的最優工藝參數為：液料比為53:1，提取時間為1.5 h，提取溫度為70 ℃，此時鼠李果實多糖的理論提取率為1.0501 %。

2.2.6 驗證性實驗 為驗證理論結果的準確性，按照理論條件進行了3次驗證試驗，3次試驗結果表明鼠李果實多糖的提取率平均值為1.0508 %，與上述預測值1.0501 %相對誤差較小。

3 討論與結論

為探討鼠李果實多糖的最佳提取工藝，在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert軟件，依據Box-Benhnken原理，對鼠李果實多糖提取工藝進行了優化，結果顯示，鼠李果實多糖的最佳提取工藝條件為：液料比為53:1，提取時間為1.5 h，提取溫度為69.80 ℃，考慮到實際試驗的可操作性，鼠李果實多糖提取的最優工藝參數為：液料比為53:1，提取時間為1.5 h，提取溫度為70 ℃，此時鼠李果實多糖的理論提取率為1.0501%。經驗證試驗表明實驗結果是可行的。所以說利用響應面法優化鼠李果實多糖的工藝參數可靠有效，可為進一步研究鼠李果實多糖提供參考。

由于實驗中提取的是粗多糖，多糖的生物活性與其結構密切相關，所以不同的多糖具有不同的生物活性。因此后續還需要進一步研究其組成、結構等。