熒光法測定水中葉綠素a的影響因素分析

鞏元帥 宋靜靜2 古小超

(1.天津市生態環境監測中心，天津 300191；2.天津市環境保護科學研究院，天津 300191)

富營養化是國內河流湖泊普遍面臨的主要環境問題，對藻類等浮游植物生長及藻華暴發具有重要的影響[1]。葉綠素a是藻類等浮游植物光合作用色素，是表征水體中浮游植物生物量的重要監測指標之一，廣泛應用于河流湖泊水質評價和富營養化評價。目前葉綠素a 的測定方法有熒光法、分光光度法、高效液相色譜法、遙感法等，其中分光光度法是國內測定葉綠素a的標準方法，該方法測定簡單，但人工提取葉綠素和測定過程較為繁瑣[2]。與分光光度法相比，熒光法可以不受采樣時間和地點的限制，消除取樣、保存、測量過程中人為因素的影響，可實現現場大批量、連續快速測定葉綠素a的含量[3]。目前，在湖泊、海洋水質在線監測中，基于熒光法的葉綠素a監測儀應用較為廣泛。

1 熒光法基本原理

葉綠素是一種酯類化合物，是由葉綠酸和甲醇、葉醇酯化反應而生成。葉綠素作為一種熒光物質，受光照后，其分子吸收了和它特征頻率相一致的光，躍遷到能量較高的激發態，激發態不穩定，返回能量較低的基態時，釋放相應的能量產生熒光。當葉綠素a經波長為450nm左右的藍光照射后，會激發出波長為680nm左右的紅光，通過檢測激發光的熒光強度，來計算葉綠素a的含量[4]。

2 熒光法影響因素

2.1 外界環境因素的影響

2.1.1 濁度

熒光法是通過測定水樣經過光照后產生熒光的強度計算葉綠素a的濃度。水樣中顆粒物、懸浮物等物質會影響光在水樣中的傳播，使激發光和熒光發生反射、散射等，對熒光測定結果造成影響。研究表明，濁度對葉綠素a測定的影響主要分為懸浮物自身產生熒光的熒光效應及對光線遮擋的遮蔽效應，兩者均會對熒光測定結果產生影響[5]。葉陳軍等[3]探討了熒光效應和遮蔽效應對測定結果的影響，并根據實測數據提供一種葉綠素熒光計基于濁度的修正方法，校準后的熒光值與真實葉綠素熒光值較為接近。

2.1.2 pH值

pH值是藻類生長過程中最重要的影響因子之一，pH值對微藻細胞生長和油脂積累的影響主要在于改變細胞膜電荷和營養物的離子化程度，進而改變細胞的活性。 水體中過酸過堿的環境條件會干擾藻類細胞對物質的吸收，影響其生長代謝活性及葉綠素產量，對熒光特性產生一定的影響。呂鵬翼[4]在研究pH值對葉綠素現場檢測儀測定結果影響中發現，當pH值在中性范圍內時，銅綠微囊藻測定值變化較小，酸性或堿性測定誤差增大。薄香蘭等[6]以小球藻為研究對象，研究不同pH值對其葉綠素熒光、葉綠素含量和細胞密度的影響，結果表明pH值為7時，熒光活性最高，pH值為9時，熒光活性下降。

2.1.3 水溫

熒光物質的熒光強度受溫度影響較大。當溫度降低時，熒光物質分子躍遷吸收的能量越高，回到基態時，釋放的熒光量子越高，熒光強度越高；溫度升高時則相反[7]。藻類等浮游植物自身受環境溫度影響較大，當溫度變化時，活體藻結構、光合速率或葉綠體的微環境發生了改變，從而影響了葉綠素a的熒光特性。呂鵬翼等[8]研究了溫度對斜生柵藻、蛋白核小球藻及銅綠微囊藻熒光強度的影響，并計算了溫度系數，結果表明隨著溫度升高，3種活體藻熒光強度均下降。

2.1.4 水樣濃度

熒光法測定溶液物質含量時，在一定濃度范圍內熒光強度與溶液濃度成正比，可根據熒光強度換算出溶液中熒光物質的含量，對于濃度較高的溶液，熒光強度與濃度不成線性關系。當溶液濃度過高時，一方面會導致激發光透光性減弱，另一方面會發生熒光自猝滅和熒光再吸收現象，導致熒光強度降低[7]。所以，在利用熒光法現場測定水體中葉綠素a的濃度時，在藻類濃度較高時，需適當進行稀釋處理。

2.1.5 其他色素

在藻類等浮游植物葉綠素分子中，除了葉綠素a，還存在葉綠素b和葉綠素c。其中葉綠素a和葉綠素b在化學性質上具有一定的相似性，兩者的激發和發射光譜存在明顯的重疊。因此，在利用熒光法現場測定水體中葉綠素a的濃度時，需對測定的熒光強度進行修正，扣除葉綠素b所產生的熒光強度。為提高測量精度，許多專家學者利用同步熒光法測定葉綠素a含量，研究表明，測定結果基本不受其他色素干擾。

2.2 擬合模型

熒光法測定水體中葉綠素a，一般采用標準工作曲線法進行計算，該方法簡單，對于水質干凈、常年變化穩定的水體，能較好地反映出熒光強度與葉綠素a濃度之間的關系。但在實際應用中工作曲線并非完全是線性的，對于復雜的水體，線性擬合會導致測定結果出現較大誤差。因此，為解決這類問題，將偏最小二乘法、神經網絡、支持向量回歸等方法應用到模型擬合中。但這些方法計算較為復雜，在擬合過程中需要較多的測量數據，建立過程比較繁瑣。

2.3 運行維護

在水質自動監測中，采用熒光法的葉綠素a在線監測儀進行監測，具有測定快捷、維護簡單等特點，適用于飲用水、海洋葉綠素a的監測。但受水體中微生物影響，儀器表面容易附著浮游植物及動物，受其生命活動影響，會加速儀器老化，導致生物腐蝕 ，影響儀器測量的穩定性和準確性。在對儀器的日常維護工作中，根據運行要求，工作人員應及時清理儀器表面附著的微生物，使儀器保持干凈。定期對儀器進行校準，開展實驗室比對，確保儀器穩定運行。當發現儀器損壞時及時進行更換備件，保證監測數據的連續性和完整性。

3 結 語

熒光法在水質較好的水體中測定結果較為準確，當水質較差時，由于影響因子較多，熒光法測定誤差則會增大。為減小環境因子對監測儀器的影響，應做好以下工作：?加強監測儀器維護，尤其在夏季，保持儀器表面清潔干凈；?采用溫度補償、濁度補償等方式，消除水溫變化、懸浮顆粒等對葉綠素a測定結果的影響；?利用同步熒光等對測試方法進行優化，扣除葉綠素b對測定結果的影響；?在擬合模型建立過程中，對比研究偏最小二乘法、神經網絡、支持向量回歸等方法在葉綠素測定中的應用，提高計算結果準確度。

利用熒光法可快速實現水體中葉綠素a含量的測定，與實驗室分光光度法相比，操作簡單、時效性強，可節省人力、物力。隨著地表水資源、海洋環境保護力度的不斷加強，水體富營養化監測工作將愈加重要，熒光法在葉綠素a測定中的應用將越來越廣泛。