Box-Behnken設計優化蔓荊子總黃酮DES提取工藝研究

王連紅，張建梅，都玲玲，姚明志，陳甘牛，劉瑞珍，孫太元*

（1.煙臺市林業科學研究所，山東 煙臺264013；2.寧海街道辦事處，山東 牟平264015；3.煙臺市森林保護站，山東 煙臺264013）

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)或蔓荊(Vitex trifoli L.)的干燥成熟果實[1]，功能疏散風熱、清利頭目，為山東道地藥材之一。單葉蔓荊不僅具固沙改土、蓄水保墑等功能[2-5]，同時還具有藥用價值[6.7]，在《國家重點保護野生藥材物種名錄》中，單葉蔓荊已被列為國家Ⅲ級瀕危保護植物[8.9]。蔓荊子含有黃酮、揮發油、萜類、生物堿等成分[10]，尤其是其總黃酮顯示出顯著的抗氧化、抗腫瘤、鎮痛、消炎、抗菌等活性。蔓荊子黃酮類以蔓荊子黃素為主，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑，因此一般采用乙醇提取總黃酮[11]。

低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是由氫鍵供體和氫鍵受體組合而成的混合物，熔點遠低于其組成物，且不易揮發、安全無毒[12]。作為一類新型綠色溶劑，DES在天然產物提取分離領域備受關注，研究應用日益廣泛。

本文以常用的氯化膽堿為氫鍵供體組份配制一系列DES用于提取蔓荊子總黃酮，以總黃酮提取率為評價指標經Box-Behnken（BBK）實驗設計優化DES提取工藝，并通過測定DPPH清除率考察所得提取物的抗氧化活性，為工業化生產蔓荊子提取物提供依據，并為其進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蔓荊子均采自煙臺市芝罘區幸福林場沿海防護林地。蘆?。暇┚爸裆锟萍加邢薰?HPLC≥98%,批號：JZ16041802），其他試劑均為分析純。

UV-Vis分光光度計；METTLER PL203型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LEGNED MICRO 17高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司），FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），Milli-Q超純水處理系統（美國Millipore公司）。

1.2 總黃酮含量測定方法

將蔓荊子藥材分別粉碎過40目篩，準確稱取藥物粉末0.1g，置10mL容量瓶中，按照試驗條件進行提取，提取液經0.22μm濾膜過濾。精密吸取上述濾液2.5mL置10mL試管中，加5%NaNO20.3 mL搖勻、放置6 min，加 10%Al(NO3)30.3 mL搖勻、放置 6 min，加 10%NaOH 4 mL搖勻、放置 20 min，在510 nm處測定吸光度(A)，并代入標準曲線（C=0.1186A+0.022，R2=0.9999）計算總黃酮濃度 C[11]。

1.3 DES種類對蔓荊子提取液中總黃酮含量的影響

準確稱取蔓荊子粉末1g置于離心管中，加入15mL DES，40℃溫浸持續攪拌 3.5h，3700rpm/min 離心5min，取上清液2 mL經適當稀釋后采用1.2項下方法測定總黃酮含量。DES種類對提取液中總黃酮含量的影響結果見圖1。

圖1 DES種類對提取液中總黃酮濃度的影響

1.4 BBK設計優化蔓荊子總黃酮DES提取工藝

根據預實驗結果，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）三個因素，以提取液中總黃酮含量為響應值，優化提取工藝條件。BBK實驗因素與水平設計見表1。

表1 BBK實驗因素水平表

等高線形狀和三維響應曲面可以反應出交互效應的強弱，根據二次擬合模型的響應曲面和等高線模型評價提取時間、提取溫度與料液比及其交互作用對蔓荊子總黃酮提取率的影響，結果見圖2。

以響應值（總黃酮提取率）最高為目標計算最優提取工藝條件。取蔓荊子粉末3份、每份1g，按最優提取條件提取，測定并計算蔓荊子總黃酮提取率，并與預測結果進行比較。

1.5 蔓荊子DES提取液DPPH抗氧化實驗研究

取樣品稀釋液100μL加等量0.1mmol/L DPPH溶液，搖勻，孵育30min后在517nm處測定其吸光度A樣品，同時測定樣品溶液吸光度A對照，DPPH溶液吸光度A空白，并按照下列公式計算自由基清除率[14]。相同條件下測定VC的DPPH抗氧化活性。

清除率（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100%

2 實驗結果與分析

2.1 DES種類對蔓荊子提取液中總黃酮含量的影響

結果表明，氯化膽堿-乳酸體系所得提取液中總黃酮含量最高，但其溶液色澤變暗，推測該體系可能影響成分的穩定性。氯化膽堿-1.3-丁二醇的提取率次佳，因此以該體系為提取溶劑進一步研究。見表2、圖1。

表2 響應中心組合試驗設計及結果

2.2 BBK優化蔓荊子總黃酮DES提取工藝

使用二次方程式的數學模型對試驗數據進行擬合，總黃酮提取率的數學模型：

R=-12.04275+1.63162B+0.24709A+0.33639C-5.02500*10-4AB+3.17500*10-3BC+4.34500*10-3AC-0.26010 B2-1.88098*10-3 A2-0.033243 C2,方程相關系數R2和R2Adj分別為0.9276和0.8344，說明模型擬合程度較好，回歸方程能較好地描述各因素與響應值之間的關系。

對響應曲面數據進行分析和顯著性檢驗，結果見表3。由表3可知，該模型顯著且失擬項無顯著性，表明模型擬合程度良好、誤差小。3個因素中C2、A2、B2對實驗結果影響顯著，且3因素影響大小依次為：A〉B〉C。

表3 回歸模型系數顯著性檢測及模型方差分析

圖2 三種因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應面與等高線

由圖2可知，各因素交互影響的響應面曲率不大、等高線均為橢圓形，說明提取溫度、提取時間和料液比的交互作用對蔓荊子總黃酮提取率均有一定的影響、但不顯著。

經軟件預測所得的最優提取條件為時間3.12h、溫度77.09℃、料液比1:10.25，此時預測的總黃酮提取率為1.75%。驗證實驗所得蔓荊子總黃酮提取率為1.68%（RSD=1.33%），與預測值基本一致。表明上述模型的預測準確度較高。

2.3 蔓荊子DES提取液DPPH抗氧化實驗研究

根據實驗結果，蔓荊子DES提取液的DPPH自由基清除率為84.76%±0.23，VC的自由基清除率為91.28%±0.58，蔓荊子DES提取液清除DPPH自由基的能力較強。

3 結論

本文借助BBK設計優化了DES溫浸提取蔓荊子總黃酮工藝條件為：料液比1:10.25條件下77.09℃溫浸提取3.12h，此時總黃酮提取率約為1.7%，體外抗氧化試驗表明所得提取物的DPPH清除率高達84.76%±0.23。DES溫浸提取操作簡便、提取率高、提取物抗氧化效果顯著，是一種較為理想的生產蔓荊子提取物的新方法。本文為進一步開發和改進蔓荊子總黃酮的生產和應用提供了理論依據。