黃芪SSR 位點研究

王 文，王金勝

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

SSR又稱微衛星（Microsatellite），為簡單序列重復（Simple Sequence Repeat），是由 1～5個核苷酸組成的首尾相連重復多次的短DNA序列[1-3]。Tautz等[4]研究發現，SSR在真核生物中具有普遍性和廣泛性。可以通過設計特異性引物對SSR位點進行PCR擴增，然后使用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測具有簡單重復序列的DNA多態性[5-6]。

黃芪為豆科黃芪屬植物，其正品黃芪為蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根。目前，市場上有一些偽黃芪，其與正品黃芪在形態、性狀及化學成分上都極為相似，所以用傳統的鑒別方法很難將其鑒別[7-8]。近年來，不斷發展的DNA分子標記技術[9-12]為黃芪的品種鑒定提供了新的方法。其中，SSR分子標記具有多態性高、重復性好、穩定性高、多等位性、共顯性和對基因組有很好的覆蓋性等特點，具有很強的實用性。現在已經證明，SSR引物在同科不同屬的物種間甚至是不同科的物種間也可擴增出重復序列。由于黃芪的分子生物學研究較少，已公布黃芪的EST序列只有140多條，僅能設計出少量的黃芪SSR引物。

本試驗從大豆中篩選出30對SSR引物，與設計的引物，相輔助對黃芪進行分子標記，旨在成功擴增出SSR位點的引物，用來鑒別黃芪的真偽。

1 材料和方法

1.1 供試材料

2012年8月在山西農業大學生命科學學院的中草藥園中，分別采集膜莢黃芪、蒙古黃芪和華黃芪新鮮幼嫩的葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 其采用CTAB高鹽法，具體步驟為：稱取黃芪嫩葉0.2 g，用滅菌蒸餾水將其洗凈晾干后，移入預冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，分裝至2.0 mLEP管中，向管中加入1.0 mL預熱的2×CTAB提取液（在水浴鍋預熱至65℃）和20μL的β-巰基乙醇，混勻，放入65℃的水浴鍋中預熱40 min，并不時輕輕搖動；室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清至新的EP管（若有懸浮物再離心）；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提液，輕輕顛倒搖勻，室溫下12 000 r/min離心10 min，取水相至新的EP管；加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提液，輕輕顛倒搖勻，室溫下12 000 r/min離心10 min，取水相至新的EP管；向EP管加入1/2體積的5 mol/L NaCl和3/4體積的異丙醇，輕輕搖勻，在-20℃冰箱靜置30 min，沉淀DNA；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，回收DNA沉淀；用70%乙醇洗滌沉淀2次，自然干燥；將DNA溶于 50μL滅菌TE中，加入 0.5μL（100μg/mL）RNaseA，輕輕搖勻，37℃溫浴1 h，短期內4℃保存備用。

1.2.2 DNA完整性和純度的鑒定

1.2.2.1 DNA完整性的鑒定 取5μL溶解的DNA，加入2μL溴酚藍試劑和1%的瓊脂糖凝膠，采用DYY-5型穩壓穩流電泳儀，在120 V電壓下電泳30 min，電泳緩沖液是pH值為8的0.5×TBE。在凝膠電泳圖像分析儀上進行拍照分析，結果如圖1所示。

1.2.2.2 DNA純度的鑒定 用雙蒸水稀釋40倍（取5μL樣加入200μL的雙蒸水）至每毫升含5～50μg DNA范圍，同時以雙蒸水作空白對照。于核酸蛋白質質量檢測儀下測出A260/A280的值，每樣品重復2次。

1.2.3 引物的篩選與設計 本試驗借用同科植物大豆的30對SSR引物，同時根據NCBI中已經公布的140多條EST序列，使用DNASTAR.Lasergene.v 7.1，SSRHunter 1.3，premier 3.0嘗試著設計引物，并根據引物設計的最適原則選取了最優的1對SSR引物[13-15]。

1.2.4 引物的PCR擴增 通過對蒙古黃芪、膜莢黃芪和華黃芪的DNA進行PCR擴增，篩選可以擴增出具有明顯多態性的引物。部分引物序列如表1所示。擴增的條件經過梯度PCR儀器優化后為：預變性 94℃ 3 min；94℃ 40 s，Tm（退火溫度）30 s，72℃ 60 s，35個循環；72℃ 8 min；4℃10 min。

表1 具有多態性的引物

1.2.5 PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳

對PCR擴增的產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用銀染法進行顯色，最后對試驗結果進行拍照。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法的選擇

本試驗采用CTAB高鹽法提取黃芪新鮮幼葉中的DNA，試驗結果如表2所示。由表2可知，提取的黃芪DNA其純度的比值均在1.80～2.00之間，質量分數在1 659.32～1 990.28μg/g之間，無RAN和蛋白的干擾。說明CTAB高鹽法適合于提取黃芪基因組DNA。

表2 所測樣品的DNA純度和質量分數

2.2 引物的擴增結果

從試驗結果可以得出，選取大豆的30對SSR引物中有6對在黃芪擴增中出現了SSR等位基因（圖 2），其編號分別為 598，168，406，315，322，215，并且根據EST序列設計的1對SSR引物（其編號暫定為1a1b）也同樣擴增出了等位基因。從成功擴增出等位基因的這7對引物中可明顯看出，不同物種中每對引物擴增出的SSR等位基因的數目、大小幾乎都有一定的差異。說明不同物種中不同的SSR位點，其側翼序列或重復序列本身具有差異性及具有不同程度上的保守性。

這7種引物在蒙古黃芪、膜莢黃芪和華黃芪中，擴增出的SSR等位基因數如表3所示。從圖2還可以看出，這3種材料很多位點的條帶都很接近，差別甚至只有幾個bp到十幾個bp，這可能是由SSR重復次數的微小差異造成的，表明了SSR位點的多態性。

表3 引物在各物種中擴增的SSR等位基因的數目

3 結論

本試驗的結果表明，用CTAB高鹽法提取黃芪幼葉的DNA，可以得到完整的具有較好純度和高質量分數的DNA。在對材料基因組信息沒有太多了解的基礎上，借用同科植物的SSR引物和根據EST序列設計SSR引物，可以避免構建DNA文庫的麻煩，節省開支，方法有效可行。本試驗所篩選和設計的SSR引物可以用來鑒別黃芪的真偽。

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