基于高分辨質譜技術的農藥與生物大分子相互作用的分析方法

李康麗 王玲玲 暴雅靜 熊 博王震宇

（華中師范大學農藥與化學生物學教育部重點實驗室，武漢 430079）

基于高分辨質譜技術的農藥與生物大分子相互作用的分析方法

李康麗 王玲玲 暴雅靜 熊 博*王震宇*

（華中師范大學農藥與化學生物學教育部重點實驗室，武漢 430079）

建立了檢測農藥小分子與生物大分子（BSA蛋白，SOD酶）相互作用的高分辨質譜分析方法。對相應結合產物進行質譜檢測，結果表明，BSA蛋白與甲基對硫磷分子在開始相互作用30 min后達到飽和，且每個蛋白分子最多與5個甲基對硫磷分子結合；BSA蛋白與甲維鹽不存在相互作用。通過對SOD酶與敵敵畏，阿維菌素及噻呋酰胺結合產物的質譜檢測發現每個SOD酶最多結合2個敵敵畏分子，1個阿維菌素分子，且不與噻呋酰胺相互作用。此外，實驗表明，SOD酶與阿維菌素分子作用30 min后達到平衡，與敵敵畏分子作用20 min后達到平衡。通過對兩種蛋白結合農藥小分子過程的時間分辨分析發現，兩種生物大分子結合農藥小分子的機理過程存在差異。本方法與相關標準方法（熒光光譜法，NBT試劑盒法）及分子模擬對接結果比對說明，本方法切實可靠。本方法具有耗樣量少、檢測速度快、可提供多方面信息等優點，在新農藥的研發及其安全性評價方面具有實用價值。

高分辨質譜；分子相互作用；農藥；牛血清白蛋白；超氧化物歧化酶

1 引言

農藥在確保糧食安全、農業穩產增收等方面發揮著重要作用，新農藥的研發具有相當的社會價值和現實意義［1］。大部分農藥為有機小分子，多通過特異性結合對應靶標蛋白抑制生物體的生理功能［2，3］，進而達到除草、殺蟲等目的。因此，研究農藥與生物大分子的相互作用不僅對相關藥理研究具有重要意義［4，5］，而且有望為新農藥的研發提供理論基礎和技術支撐。目前，基于核磁共振［6，7］、光譜［8～10］、圓二色譜［8］、分子模擬對接［9，10］等技術檢測小分子與生物大分子相互作用已見諸報道，這些方法不同程度地存在樣品消耗量大、耗費時間長等不足。鑒于此，本實驗建立了用于監測農藥-生物大分子相互作用的高分辨質譜分析方法。通過對質譜檢測條件的充分優化，實現了對農藥-生物大分子結合產物的質譜分析［11，12］，基于蛋白結合農藥前后的質量數位移，確定單個蛋白分子所結合的最大農藥分子個數，并最終區分是否存在相互作用。此外，還探索了農藥與生物大分子相互作用的時間分辨分析，將所測結果與熒光光譜法［8～10］，NBT試劑盒法［13］及分子模擬對接［9，10］等方法的結果進行了比對，本方法的可靠性獲得了確證。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（USA）；6224 TOF-ESI-MS質譜儀（USA）。熒光光譜儀，酶標儀（BioTek，USA），96孔板，移液槍。牛血清白蛋白（BSA，純度＞98%，MW≈66 kDa）；超氧化物歧化酶（SOD，純度＞90%，MW≈32 kDa）；甲基對硫磷，甲維鹽，阿維菌素，噻呋酰胺，敵敵畏（標準品）；NBT試劑盒；乙腈，甲醇（德國默克公司）；甲酸（分析純）；實驗室用水為純水儀（美國Millipore公司，USA）制備的二次蒸餾水。

2.2 溶液的配制

準確稱取1.98 mg BSA于離心管，加入1.5 mL二次蒸餾水進行溶解（20 mmol/L），于4℃存放備用；稱取1.15 mg SOD于離心管，加入1.15 mL二次蒸餾水溶解（30μmol/L），然后分別稀釋成3和6μmol/L的樣品液，分裝，于-20℃存放備用。

2.3 質譜檢測條件

BSA檢測濃度:20μmol/L，質荷比采集范圍:m/z 900～2400；SOD檢測濃度:3μmol/L（樣品先加0.1%甲酸酸化），質荷比采集范圍:m/z 800～1800。離子源:ESI，流動相:50%乙腈-50%二次蒸餾水（含0.1%甲酸），進樣量:2 μL，流速:0.200 mL/min。

3 結果與討論

3.1 BSA蛋白和SOD酶的質譜檢測

在優化的高分辨質譜條件下，實現了對BSA蛋白和SOD酶的較好檢測。由圖1a可見，帶+32到+64電荷的BSA分子離子，帶+9到+19電荷的SOD分子離子都能被檢測到（圖1b）。

圖1 BSA（a）和SOD（b）的質譜圖，BSA結合甲基對硫磷的質譜圖（c），SOD結合敵敵畏的質譜圖（d）Fig.1 MS spectra of BSA（a），superoxide dismutase（SOD）（b），BSA interacted with Parathion-methyl （c）and SOD interacted with dichlorvos（DDVP）（d）

3.2 BSA蛋白和SOD酶與農藥小分子的相互作用

使用前述質譜方法對不同濃度的甲基對硫磷、甲維鹽與BSA蛋白之間的相互作用進行了評價。如圖2a所示，當BSA蛋白與甲基對硫磷作用30 min后，可見其帶有相應電荷碎片的質量數皆存在一定的位移，此位移值即對應所結合甲基對硫磷的質量數［14］。該位移值與所帶電荷數的乘積與甲基對硫磷分子量的比值即為此狀態下單個BSA蛋白分子上所結合的甲基對硫磷的分子個數，約5個。另一方面，BSA蛋白與甲維鹽充分孵育后，并未發生任何質量數的位移（圖2b）。由此可判定BSA蛋白與甲維鹽不存在相互作用。

評價了SOD酶與阿維菌素、敵敵畏、噻呋酰胺的相互作用，相關數據參見表1，SOD酶與阿維菌素、敵敵畏結合后，檢測出了帶有十余個電荷的新的碎片離子，根據相應碎片質量數位移值最終確定此狀態下單個SOD酶分子結合1個阿維菌素分子，2個敵敵畏分子，SOD酶與噻呋酰胺不存在相互作用。

綜上所述，基于所建立之方法可通過檢測蛋白與農藥結合前后的質量數位移對是否存在相互作用進行判斷，繼而根據位移值以及相應農藥分子的精確分子量計算得到單個蛋白分子所結合的農藥分子個數，相關農藥的質譜檢測結果見表2。

圖2 BSA分別于甲基對硫磷（a）和甲維鹽（b）相互作用Fig.2 MS spectra of BSA interacted with parathion-methyl（a）and emamectin benzoate（b）

表1 SOD酶與阿維菌素、敵敵畏作用產物的質譜數據總結Table 1 MS data summarization of SOD interacted with avermectin and DDVP

表2 與SOD及BSA作用的5種農藥Table 2 Informations for five pesticides bonded with SOD or BSA

3.3 BSA和SOD與農藥小分子相互作用的時間分辨分析

基于所建立的質譜方法探索了SOD酶與阿維菌素、敵敵畏結合過程的時間分辨分析。由圖3a可見，將濃度比為1∶5的SOD酶與阿維菌素的混合液于25℃分別孵育5，10，15，20，30和40 min后，結合農藥的SOD酶的新的碎片峰離子強度不斷變化，并于30 min后趨于穩定。由此可見，SOD酶結合阿維菌素的過程在30 min后趨于平衡。在對應的條件下SOD酶和敵敵畏的檢測結果（圖3b）可見，兩者結合產物對應的離子強度于20 min左右趨于穩定。由此判定，SOD酶與敵敵畏的結合于20 min左右趨于平衡。實驗表明，SOD酶與阿維菌素、敵敵畏的相互作用過程中皆存在一個逐步趨近于飽和平衡的過程，此過程具有相對漸進發生、逐步達到平衡的特點。

圖3 農藥與生物大分子結合的時間分辨分析Fig.3 Time-resolved result of biological macromolecules bonded with pesticide

BSA蛋白-甲基對硫磷混合液（1∶5，V/V）于37℃孵育后，通過檢測結合產物的強度對此相互作用過程進行時間分辨分析。由圖3c可見，當孵育時間小于15 min，檢測到BSA蛋白與甲基對硫磷的結合產物離子強度為零，即穩定的相互作用產物尚未完全生成；隨著孵育時間增長至15 min，產生位移；孵育時間繼續增長，位移值保持不變。由圖3c可見，新的碎片峰的離子強度于20 min趨于穩定，即BSA蛋白與甲基對硫磷的結合于20 min趨于平衡。結果表明，BSA與甲基對硫磷的的結合與SOD結合相應農藥分子的過程存在顯著區別。由該曲線推測BSA與甲基對硫磷結合過程中可能存在著某種協同準備階段，當該過程結束后農藥小分子會在較短時間內結合到對應蛋白的作用位點。這主要可能由于BSA蛋白與SOD酶的分子空間結構的差異以及蛋白空腔作用位點個數的不同所致。

3.4 檢測方法可靠性評價

為評價本方法的可靠性，選用熒光光譜法［8］和NBT試劑盒法［13］對前述的分子間相互作用進行了檢測。首先，將甲基對硫磷、甲維鹽與BSA蛋白以及阿維菌素、敵敵畏、噻呋酰胺與SOD酶分別混合。由圖4a可見，甲維鹽的加入與否對BSA的熒光強度以及位移均沒有影響，但混合了甲基對硫磷的BSA熒光強度下降；且隨著甲基對硫磷含量的增加，熒光強度下降顯著。由此可知，甲基對硫磷與BSA蛋白有很強的相互作用，但甲維鹽與其不存在相互作用。同樣地，加入了阿維菌素、敵敵畏的SOD酶的熒光強度及位移均發生了變化，而加入了噻呋酰胺的SOD酶熒光強度及位移不受影響（圖4b）。由此推斷，阿維菌素，敵敵畏與SOD酶存在明顯相互作用，但噻呋酰胺與SOD酶不存在相互作用。此外，對BSA與甲基對硫磷的相互作用進行了分子模擬對接，結果見圖4c。結果表明，二者之間有很強的氫鍵作用力，進一步證明兩者存在較強的相互作用。采用NBT試劑盒對SOD酶的活力進行檢測，與噻呋酰胺混合的SOD酶活力并沒有發生變化。由此可見，二者不存在相互作用，檢測結果見圖4d。混合了敵敵畏和阿維菌素的SOD活力有所上升，這與文獻［14］一致。圖4揭示了BSA與甲基對硫磷之間存在相互作用，與甲維鹽不存在相互作用；SOD與阿維菌素，敵敵畏之間存在相互作用，與噻呋酰胺不存在相互作用。此結論與前述建立的方法所得結果一致，從而證明本方法切實可靠。

4 結論

本實驗探索了一種基于高分辨質譜技術的農藥-生物大分子相互作用的分析方法。根據相應大分子碎片質量數位移能快速判定農藥與生物大分子是否存在相互作用，并根據位移數值的大小準確得出結合的農藥小分子個數，同時該方法還能對結合過程進行時間分辨分析。依據前述過程分析的相應結果，所研究之農藥與生物大分子的結合相對較為緩慢，不符合靜電吸引結合的基本特征。此外，結合分子對接結果，初步推斷此相互作用方式有可能為小分子嵌入大分子的結合模式。本方法具有消耗樣品少、可靠性高、可提供多方面信息的優勢，有望廣泛應用于潛在農藥分子的前期篩選及其安全性評價工作中。

圖4 標準方法檢測結果:BSA的熒光光譜圖（a），BSA分子對接圖（c），SOD的熒光光譜圖（b），SOD的NBT試劑盒檢測結果圖（d）Fig.4 Detection results of standard method:Fluorescence spectra of BSA（a），gold docking results of BSA（c），fluorescence spectra of SOD（b），NBT method result of SOD（d）

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21205044，21302060）and self-determined research funds of CCNU from the colleges'basic research and operation of MOE（Nos.CCNU14A05005，CCNU15KFY004 ）

Analysis of Interaction between Pesticide and Biological Macromolecules Based on High Resolution Mass Spectrometry

LI Kang-Li，WANG Ling-Ling，BAO Ya-Jing，XIONG Bo*，WANG Zhen-Yu*
（The MOE Key Laboratory of Pesticide&Chemical Biology，Central China Normal University，Wuhan 430079，China）

An analytical method for the determination of interaction between pesticide and biological macromolecules（bovine serum albumin（BSA）protein，superoxide dismutase（SOD）enzyme）was developed based on high resolution mass spectrometry.All results revealed that each BSA bonded with maximum five Parathion-methyls after 30 min，and it would not interact with emamectin benzoate.Moreover，each SOD after mixing with corresponding pesticides could bond with two dichlorvos（DDVPs）and one avermectin after 30 min.In addition，there is no interaction between SOD and thifluzamide.The interaction between SOD and avermectin trended stable after 30 min，and similar phenomenon was observed between SOD and DDVP after 20 min.There were certain obvious some differences in the pathway of interactions for BSA and SOD，both of which were bonded with the pesticides，based on time resolved determinations for their bonding process. Finally，we compared the proposed method with standard methods（fluorescence spectrometry，NBT kit method）and molecular docking results，and the reliability of the proposed method was supported.It owned preponderances in less sample consumption，high detection speed，and more capacities compared with traditional strategies.Therefore，the proposed mothed would own certain practical values in either researches and developments or safety evaluations for new pesticides.

High resolution mass spectrometry；Molecular interactions；Pesticides；Bovine serum albumin；Superoxide dismutase

14 September 2015；accepted 5 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150725

2015-09-14收稿；2015-11-05接受

本文系國家自然科學基金（Nos.21205044，21302060）和高校教育部基礎研究經費（Nos.CCNU14A05005，CCNU15KFY004）的資助

* E-mail:bx@mail.ccnu.edu.cn，zywang@mail.ccnu.edu.cn