超聲波制備肝素芐基酯優(yōu)化工藝研究

楊彬，王志耕

(安徽農業(yè)大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036)

依諾肝素鈉是堿解聚伊諾肝素芐基酯制備而成的低分子肝素[1]，是目前抗凝、抗栓治療的主要藥物[2-3]。制備肝素芐基酯的酯化率與反應物濃度、溫度及時間等因素相關[4]。傳統(tǒng)工藝耗時長、成本高，需要20～35 h以上[5-8]。超聲波反應溫和，在傳質、傳熱和化學反應等方面具有獨特作用，已廣泛應用于生物、化工、制造等領域[9]。本實驗引入超聲波制備肝素芐基酯，期望縮短反應時間、提高產率和酯化率，減少有機物的使用和殘留，獲得最優(yōu)制備工藝。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

肝素鈉，工業(yè)品；肝素鈉標準品、多硫酸軟骨素標準品均購自中國藥品生物制品檢定所；苯甲醇、高氯酸鋰、芐索氯銨(97%)、磷酸、磷酸二氫鈉、甲醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰乙酸、二氯甲烷等均為分析純；氯化芐、甲醇、乙腈均為優(yōu)級純。

ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀；Breeze 2 高壓液相色譜儀；Specord S600紫外可見記錄分光光度儀；MS205DU和 AL104型電子分析天平；3670離心機；KQ500DE型超聲波清洗器；DZF-6090型真空干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗品肝素鈉的純化 稱取粗品肝素鈉40 g，溶于含12 g氯化鈉的400 mL去離子水溶液中。加入320 mL甲醇，攪拌、沉淀1 d。過濾。濾餅40 ℃真空干燥。測定蛋白核酸的紫外吸收值和多硫酸軟骨素含量。

1.2.2 肝素季銨鹽的制備 將純化的19.4 g肝素鈉溶于200 mL純水中，注入含50 g芐索氯銨的250 mL水溶液中，攪拌并離心，用水不斷沖洗，直到沖洗液變透明，獲得肝素季銨鹽，45 ℃真空干燥。

1.2.3 肝素芐基酯的制備 將1 g肝素季銨鹽加入到5 mL二氯甲烷中，攪拌溶解。加入氯化芐1 mL，放入超聲功率為400 W的超聲波清洗器中，溫度為35～40 ℃，超聲反應5.5 h，做3個平行樣。反應結束后，加入6 mL的10%醋酸鈉甲醇溶液[4]，得肝素芐基酯沉淀，離心，用甲醇反復洗滌，直到無刺激性氣味，于45 ℃真空干燥24 h。

1.3 多硫酸軟骨素的檢測

1.3.1 色譜條件[10]Waters Breeze 2高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測器，色譜柱TSK-GEL EDAE-5pw(75 mm ×2 mm，10 μm)，流動相A為2.5 mmol/L 磷酸二氫鈉(用磷酸調節(jié)至pH 3.0，0.22 μL 濾膜)，流動相B為2.5 mmol/L磷酸二氫鈉、1 mol/L高氯酸鋰(用磷酸調節(jié)至pH 3.0，0.22 μL濾膜)，梯度洗脫方法：0～2 min，10%B-10%B；3～7 min，20%B-20%B；7～15 min：20%B-100%B；5～25 min：100%B-100%B；檢測波長202 nm，柱溫箱35 ℃，進樣量10 μL，流速0.2 mL/min。

1.3.2 標準曲線繪制 配制0.40，1，1.7 mg/mL的多硫酸軟骨素標液，經HPLC檢測，繪制標準曲線。以濃度(mg/mL)為縱坐標(y)，以面積為橫坐標(x)，回歸方程為y=8×10-8x+0.258(R2=0.961)，結果表明硫酸軟骨素溶液在0.4～1.7 mg/mL的濃度范圍內線性關系良好。

1.3.3 樣品分析 用超純水配制成含20.0 mg/mL的原料肝素鈉和純化后的肝素鈉溶液。以超純水為溶劑，配制含1 mg/mL肝素鈉標準品溶液。用HPLC測定多硫酸軟骨素含量，與對照品溶液的標準品比較。純化后的肝素鈉中多硫酸軟骨素含量必須小于總含量的2%。

1.4 肝素芐基酯含量分析

本研究將酯化率定義為肝素芐基酯水解后的苯甲醇質量與肝素芐基酯質量的百分比。

1.4.1 色譜條件 超高效液相色譜儀Waters Uplc Class超高效液相色譜儀，TUC detector檢測器，色譜柱ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm 2.1 mm×50 mm)，流動相[11]為水∶乙腈∶甲醇=80∶15∶5，檢測波長256 nm，柱溫25 ℃，進樣體積1 μL，流速0.5 mL/min，運行時間2 min。

1.4.2 標準曲線繪制 配制濃度0.5 mg/mL的苯甲醇標準儲備液，稀釋至0.05，0.07，0.1，0.15，0.175 mg/mL的工作液，過0.22 μL濾膜后進HPLC分析，苯甲醇濃度(mg/mL)為橫坐標(x)，以測得的峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，得到回歸方程y=182 307x-227.79，R2=0.999 9，表明甲醇溶液在0.05～0.175 mg/mL線性相關性好，根據該標準曲線可以對水解液中的苯甲醇進行定量分析。

1.4.3 樣品分析 取0.125 g肝素芐基酯于25 mL容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 mL，室溫反應1 h。加1 mL冰醋酸，終止反應。加水定容至25 mL，使得肝素芐基酯的終濃度為5 mg/mL[12-13]。取1 μL按照上述HPLC條件測定樣品中苯甲醇的峰面積，經回歸方程測得其濃度，計算酯化率。

酯化率=(C2/C1)×100%

“我很高興自己能駕駛這輛沃爾沃P1800通勤這么多年，它也從未因故障把我落在路邊。我希望能一直就這么開著它，直到有一天我離開人世。其實，它的狀態(tài)遠比我的身體狀態(tài)要好很多。”

式中，C1為待測樣品肝素芐基酯的質量濃度，C2為待測液中苯甲醇的質量濃度。

2 結果與討論

2.1 肝素鈉粗品純化后的雜質分析

肝素主要分布在動物細胞的肥大組織中，與蛋白質結合形成復合物，而這種復合物無抗凝血活性，蛋白質去除后肝素的抗凝活性才得以體現(xiàn)[14]。目前主要通過酶水解、鹽析等方法去除原料肝素鈉中的蛋白質，得到肝素鈉粗品。因經酶水解后的肝素鈉原料中蛋白質被分解為多肽，且含有如硫酸軟骨素類的雜質，又不易在高溫，強酸強堿等情況下去除蛋白質，易使肝素鈉失去活性。肝素的純化一般為氧化法，加雙氧水、高錳酸鉀等，得率低，且影響活性。粗品肝素鈉40 g經純化后得到為19.7 g肝素鈉，測定結果見圖1、圖2。

圖1 0.4 mg/mL 原料液波段掃描圖Fig.1 Band scan figure of crude heparin solution at 0.4 mg/mL

圖2 純化后0.4 mg/mL肝素鈉溶液波段掃描圖Fig.2 Band scan figure of purified heparin solution at 0.4 mg/mL

由圖1、圖2可知，粗品肝素鈉在A260、A280的吸收值為2.937 1和1.650 9，純化后為0.374 6和0.218 4。用甲醇純化石，蛋白質和核酸含量明顯降低，粗品肝素鈉在180～200 nm處有很多的雜峰，經純化后，峰型單一，在A190處有肝素鈉的特征性吸收峰。整個純化過程溫和且沒有引入新雜質，起到了很好的除雜效果。

2.2 多硫酸軟骨素的檢測

多硫酸軟骨素的結構、電荷密度、分子量、抗凝活性均與肝素相似，因此在肝素鈉中發(fā)現(xiàn)OSCS較為不易。肝素鈉中有關物質尤其是多硫酸軟骨素的分析成了肝素類藥物研究的重點和難點[15]，快速檢出摻雜了OSCS的肝素鈉是提高肝素鈉相關產品安全性和質量標準的關鍵。各溶液測定結果見圖3。

圖3 各物質的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of solutions of standard sample， crude heparin and its purified product

由圖3可知，多硫酸軟骨素和肝素鈉出峰時間分別為13.878 min和17.235 min，分離度較好。本實驗用的粗品肝素鈉采用酶法生產，原料液和純化液中均未發(fā)現(xiàn)有OSCS。純化液峰面積與肝素鈉標樣峰面積的比值為15.69，而原料液與肝素鈉標樣峰面積的比值為9.98，20 mg/mL純化液中肝素鈉含量為20 mg/mL，為原料肝素鈉含量的1.57倍，純度提高了57.21%，雜質被分離。

2.3 超聲波輔助酯化的實驗結果

2.3.1 超聲功率對肝素芐基酯的影響 將反應液放入超聲波清洗器中，溫度為35～40 ℃，超聲酯化反應3 h。超聲波功率對肝素芐基酯酯化率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對酯化率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on esterification level

由圖4可知，隨超聲功率增大，酯化率增大，超聲功率在400 W時，酯化率較高，以后增加趨于平緩。超聲波在通過液體時產生空化氣泡，氣泡在超聲波傳播時，振蕩破裂，造成熱力效應、機械效應和化學效應[16]，加速了物質分子間的碰撞，從而加快反應，縮短反應時間，提高酯化率[17]。當超聲波功率由低到高時，產生的空化作用由弱變強，引起酯化率顯著增加。當超聲功率達到500 W的時候，酯化率的增加速度有所降低，以防功率過高，引起肝素芐基酯長鏈分子的降解，所以選擇最佳超聲功率為400 W。

由圖5可知，隨著反應時間的增加，酯化率逐漸提高，5 h以后其提高速率有所減緩。在超聲過程中，超聲波振蕩產生的強烈空穴效應、自由基效應[18]、熱力學和非熱力學等多重效應的作用，增強了分子間的作用力，同時其自由基效應在空穴氣泡崩饋時，其氣泡內部氣相在高溫高壓條件下裂解成 —H和 —OH，以及在空穴氣泡與周邊液體界面上由于極端的溫差導致能量集中，使溶液熱解產生自由基的現(xiàn)象，加速了酯化作用。酯化作用不可能無限的進行，當溶液達到飽和時，酯化反應達到平衡，酯化率將不再升高。在超聲4 h時，其酯化率已達到4.72%，相當于在水浴中反應25 h的酯化率4.65%。超聲5～6 h，酯化率增加趨于減緩，所以確定最佳超聲時間為5.5 h。

圖5 時間對酯化率的影響Fig.5 The effect of time on esterification rate

2.4 響應面優(yōu)化實驗

在肝素芐基酯的反應中，金飛等人已研究證明當溫度為35～40 ℃時，酯化率較好。同時二氯甲烷的沸點為40 ℃，如果溫度過高，也會影響肝素季銨鹽的活性，影響低分子肝素鈉的效價，所以選擇時間和功率，作為主要因素，采用Design-Expert8.0.06響應面設計中的Miscellaneous模型優(yōu)化設計實驗，以肝素芐基酯酯化率為響應值，因素與水平見表1，結果見表2。

表1 酯化率優(yōu)化設計及編碼水平Table 1 Optimum design factor and level of heparin benzyl esterfication

表2 Miscellaneous實驗設計與結果Table 2 The Miscellaneous design and its results

2.4.1 模型的建立及其顯著性分析 利用Design-Expert8.0.0.6軟件對上表數(shù)據進行多元回歸擬合，得到響應值(Y)對編碼自變量的二次多項回歸方程是：Y=5.55+0.17A+0.50B+0.10AB-0.33A2-0.36B2。對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

表3 響應面方差分析Table 3 The response surface analysis of variance

由表3可知，模型F值為 12.105 3，概率P=0.002 5<0.05，模型顯著；模型的失擬項p=0.636 5>0.05，表明模型能夠解釋99.80%的實驗結果，模型的變異系數(shù)CV%=1.59，說明模型的精密度好。同時，方程的失擬項F值為0.623 2，概率P>0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該回歸模型代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

由表3可知，對響應值作用極顯著的是B，作用顯著的是A2、B2，說明響應值與因素之間并不是簡單的線性關系；時間對酯化率的影響非常明顯。

2.4.2 響應面曲線圖 采用Design-Expert8.0.0.6軟件繪制響應面曲線圖，結果見圖6。

圖6 超聲功率和時間對酯化率的響應面圖Fig.6 A response surface plot of ultrasonic power and reaction time on esterification rate

由圖6可知，隨著時間和功率的增加，酯化率逐漸增加，功率400～500 W時，酯化率隨著時間的增加，達到了最佳值；當響應值達到一定程度后，會逐漸降低。

2.4.3 反應條件的優(yōu)化及模型驗證 模型給出的最優(yōu)預測值為超聲功率400 W，反應5.5 h，溫度35～40 ℃時，理論酯化率為5.55%。在上面的條件下做3個平行樣，實際測得值為5.35%，與預測值相對偏差為3.60%，與理論值基本吻合。說明采用響應面法優(yōu)化得到的酯化條件準確可靠，具有實用價值。

3 結論

(1)利用甲醇純化肝素鈉原料，純化后肝素鈉含量為純化前的1.57倍；利用弱陰離子高效液相法檢測，測得樣品中不含多硫酸軟骨素。

(2)超聲制備肝素芐基酯的優(yōu)化條件為：溫度35～40 ℃，超聲功率400 W，反應時間5.5 h，酯化率為5.35%。比常規(guī)工藝節(jié)省了20 h左右，且酯化率提高15.05%。