小鼠ESCs誘導(dǎo)分化的研究

文│相榮科（北京農(nóng)學(xué)院、山東省蘭陵縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心）

馬永艷 梁樹凱（山東省蘭陵縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心）

高建明 穆祥（北京農(nóng)學(xué)院）

胚胎干細(xì)胞（ESCs）作為一種全能性細(xì)胞，可體外培養(yǎng)無限增殖，并自我更新和向多種細(xì)胞分化。對(duì)于不能再生的心肌細(xì)胞，若能通過誘導(dǎo)ESCs分化為純度高的心肌細(xì)胞，參與心肌的再生及修復(fù)，在加快其在臨床上的應(yīng)用及治療心臟疾病方面具有極其重要意義。淫羊藿苷（ICA）作為一種生物活性較強(qiáng)的中藥提取物，可改善心腦血管的血流量、改善心血管系統(tǒng)功能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及干細(xì)胞分化等，還可誘導(dǎo)ESCs分化為心肌細(xì)胞。

微血管內(nèi)皮作為內(nèi)分泌器官，其代謝非常活躍，可調(diào)節(jié)體內(nèi)生理功能及多種生物應(yīng)答，并可分泌多種細(xì)胞因子，在組成血管組織屏障、維持機(jī)體生理、調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫功能、介導(dǎo)疾病（發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸）等方面發(fā)揮非常重要作用，并且促進(jìn)干細(xì)胞的增殖及分化。本試驗(yàn)重在探索小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hMVECs）條件液及ICA對(duì)ESCs分化的作用，在ESCs分化培養(yǎng)液中添加hMVECs條件液、ICA、ICA聯(lián)合hMVECs條件液，探索hMVECs條件液能否誘導(dǎo)ESCs分化為心肌樣細(xì)胞；ICA與hMVECs條件液聯(lián)合誘導(dǎo)，探討二者對(duì)ESCs向心肌樣細(xì)胞分化是否有綜合作用，從而進(jìn)步提高心肌樣細(xì)胞分化率及純度，體外生產(chǎn)批量心肌細(xì)胞，為研究心肌發(fā)育、心肌藥物篩選與心肌損傷治療等方面提供一條新思路。觀察ICA、hMVECs條件液誘導(dǎo)mESCs（小鼠ESCs）分化小鼠胚胎干細(xì)胞為心肌樣細(xì)胞效果。

本試驗(yàn)以m E S C s 分化培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，分別用10-7摩爾/升ICA、50% hMVECs條件液、10-7摩爾/升ICA聯(lián)合50% hMVECs條件液誘導(dǎo)mESCs的分化，對(duì)誘導(dǎo)后的mESCs繼續(xù)培養(yǎng)1周，用免疫化學(xué)方法及RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞中心肌特異性蛋白（cTnT）及基因（MLC-2v、α-MHC、β-MHC、Nkx2.5、GATA-4）的表達(dá)，并用cTnT算出分化率。各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后細(xì)胞中均有c T n T 及以上5 種心肌特異性基因表達(dá)，其中分化率ICA組（44.35±3.84）和聯(lián)合誘導(dǎo)組（44.93±0.86）均極顯著高于hMVECs條件液組（5.46±1.24）（P＜0.01）。hMVECs條件液可體外誘導(dǎo)mESCs分化成心肌樣細(xì)胞，二者聯(lián)合未能顯著提高分化率。

一、材料和方法

1.材料及試劑。mESCs（廣州賽業(yè)）、昆明白小鼠（6～8周齡SPF級(jí)，北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF，自制）、SP試劑盒（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）、DAB試劑盒（Solarbio）、RT-PCR試劑用品（北京全式金）、引物（北京奧科）、絲裂霉素-C（Roche）、β-巰基乙醇（β-ME，Amreco）、胎牛血清（FBS，四季清）、0.25%Trypsin-EDTA消化液和特級(jí)FBS（Giboc），其他藥品均購自sigma公司。MEF培養(yǎng)液：H-DMEM+10%FBS+100IU/毫升青霉素+1 0 0 微克/毫升鏈霉素。ESCs培養(yǎng)液：H-DMEM+FBS（20%）+β-ME（0.1毫摩爾/升）+L-谷氨酰胺（2毫摩爾/升）+青霉素（100IU/毫升）+鏈霉素（100微克/毫升）+非必需氨基酸（1%）+白血病抑制因子（LIF，10納克/毫升）。ESCs分化培養(yǎng)液為不含LIF的ESCs培養(yǎng)液。

2.飼養(yǎng)層制備及ESCs培養(yǎng)。用常規(guī)方法剝離孕12.5～14.5天小鼠子宮內(nèi)胎鼠軀干，0.25%胰酶消化。用MEF培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行1∶3傳代。飼養(yǎng)層制備選用3～5代的MEF，用10微克/毫升絲裂霉素-C處理2小時(shí)后備用。將ESCs接種于MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。

3.ESCs體外分化培養(yǎng)。消化后的ESCs以5×104/毫升的濃度接種到24孔板中，在ESCs分化培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后，對(duì)ESCs細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)組為以下三組：10-7摩爾/升ICA誘導(dǎo)24小時(shí)，用分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天；含50% hMVECs條件液的ESCs分化培養(yǎng)液共培養(yǎng)8天；用10-7摩爾/升ICA與50% hMVECs條件液誘導(dǎo)24小時(shí)，再用50% hMVECs條件液的ESCs分化培養(yǎng)液共培養(yǎng)7天。對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞采用免疫細(xì)胞及RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。

4.免疫細(xì)胞方法鑒定。鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞中cTnT表達(dá)，以cTnT陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)算出分化率。4%多聚甲醛固定30分鐘，其余步驟按SP試劑盒及DAB試劑盒進(jìn)行。在倒置顯微鏡100倍視野下，每孔取4個(gè)視野，分化率即為棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)的比值。

5.RT-PCR方法鑒定。通過RT-PCR鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞中MLC-2v、α-M H C、β-M H C、N k x 2.5、GATA-4的表達(dá)。用Tranzol裂解細(xì)胞，提取總RNA。取1微克mRNA用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。第一鏈cDNA合成及RT-PCR的反應(yīng)條件與步驟分別按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和2×EasyTaq PCR SuperMix進(jìn)行。引物序列引自淫羊藿苷誘導(dǎo)mESCs分化為心肌樣細(xì)胞的研究。

6.數(shù)據(jù)處理。用SPSS16.0（One-Way ANOVO）對(duì)分化率分析，數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

二、結(jié)果

1.免疫細(xì)胞染色及分化率統(tǒng)計(jì)。

表1 各組分化率比較

誘導(dǎo)8天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞染色，對(duì)照組未有陽性細(xì)胞，各試驗(yàn)組均有陽性細(xì)胞出現(xiàn)（圖1）。由表1可見，分化率ICA和聯(lián)合誘導(dǎo)組極顯著高于50%hMVECs條件液組（P＜0.01），但I(xiàn)CA與聯(lián)合誘導(dǎo)組間無顯著性差異（P＞0.05），以聯(lián)合誘導(dǎo)組效果最好（44.93%）。

2.誘導(dǎo)后細(xì)胞M L C-2 v、α-MHC、β-MHC、Nkx2.5、GATA-4基因的表達(dá)。各基因在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)見圖2。由圖2的B圖可見有基因5種基因表達(dá)。而圖2的A圖空白對(duì)照組未觀察到任何條帶，即未有上述基因表達(dá)。

◎圖2 基因誘導(dǎo)后細(xì)胞中的表達(dá)

三、討論

ICA可改善患者心血管系統(tǒng)功能并對(duì)心腦血管具有良好保護(hù)作用，可降低心臟指數(shù)、縮小心肌梗死面積、降低心肌酶活性、對(duì)心臟缺血再灌注損傷也有一定的保護(hù)作用。微血管內(nèi)皮可分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、前列腺素（PGs）、血栓素A2（TXA2）、一氧化氮（NO ）、內(nèi)皮素（ET） 、白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6 （IL-6）、E-選擇素（E-selectin）、P-選擇素（P-selectin）等。Miwako等的研究中，在ESCs向心肌細(xì)胞分化過程中，外源性內(nèi)皮細(xì)胞可刺激ESCs分化為心肌細(xì)胞，并能增加心肌細(xì)胞數(shù)量，極具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。石靜寶等用間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)，可加速心肌組織形成并可促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)化的構(gòu)建。

有研究表明VEGF可抑制心肌細(xì)胞凋亡，并且新西蘭兔骨髓間充質(zhì)干經(jīng)細(xì)胞腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和VEGF雙基因轉(zhuǎn)染，之后移植可影響新西蘭兔梗死心肌組織的修復(fù)重建及血管再生。ET-1不僅能促心肌樣細(xì)胞肥大及成熟，也可促干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，林永青等用Vit-C與ET-1聯(lián)合，可使獲得心肌細(xì)胞進(jìn)一步純化。NO或外源性NO可促進(jìn)小鼠ESCs分化成心肌樣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在ESCs分化培養(yǎng)體系中添加ICA、hMVECs條件液，二者聯(lián)合使其向心肌樣細(xì)胞分化，從免疫細(xì)胞染色結(jié)果闞，誘導(dǎo)后有cTnT的表達(dá)。通過對(duì)分化率較低hMVECs條件液組別中，對(duì)5種心肌特異性基因進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)步證實(shí)了誘導(dǎo)后細(xì)胞具有心肌樣細(xì)胞的特征。

通過ICA與hMVECs條件液聯(lián)合誘導(dǎo)結(jié)果可見，心肌樣細(xì)胞的分化率與ICA組無顯著差異。ICA的生物活性非常強(qiáng)，對(duì)于多組織、器官、內(nèi)分泌、心血管系統(tǒng)及抗腫瘤等方面都有重要作用。有研究，ICA參與了某些生物學(xué)和病理學(xué)過程，降低了心肌耗氧量及外周阻力，可明顯改善心肌缺血和心律失常等疾病。也可上調(diào)HSP2，從而減少心肌缺血或再灌注損傷。ICA能促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌VEGF和bFGF，并隨著時(shí)間的增加分泌量增加。ICA可上調(diào)NO信號(hào)通路有關(guān)的心臟轉(zhuǎn)錄因子如GATA-4、Nkx2.5mRNA、MLC-2v及α-MHC的表達(dá)，且呈現(xiàn)明顯時(shí)效和量效性。ICA誘導(dǎo)ESCs分化為心肌樣細(xì)胞效果優(yōu)于hMVECs條件液，可能與促進(jìn)細(xì)胞的分泌功能和上調(diào)NO信號(hào)通路相關(guān)因子的水平有關(guān)。hMVECs條件液中含有多種成分，每種因子又對(duì)心肌或心臟有直接或間接作用，但其誘導(dǎo)ESCs分化成心肌樣細(xì)胞是一種還是多種因子互作的結(jié)果，其機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

◎圖1 分化后細(xì)胞抗cTnT染色（×100）注：A：空白對(duì)照組；B：hMVECs條件液組；C：ICA組；D：二者聯(lián)合組。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)得出ICA和hMVECs條件液均可在體外誘導(dǎo)mESCs分化為心肌樣細(xì)胞。用10-7摩爾/升ICA和50% hMVECs條件液聯(lián)合誘導(dǎo)組效果最好，但二者聯(lián)合未能顯著提高心肌樣細(xì)胞分化率，至于二者之間是否存在互作還需進(jìn)一步研究。