不同產(chǎn)地薏苡仁多糖的單糖組成分析

王奎龍　曹崗　何帥瀅

摘要? [目的]分析不同產(chǎn)地薏苡仁多糖的單糖組成。[方法]收集不同產(chǎn)地的薏苡仁，以水提醇沉的方法獲得薏苡仁粗多糖，并采用苯酚-硫酸法對(duì)各樣品中多糖的含量進(jìn)行測(cè)定;進(jìn)一步使用HPLC-UV法對(duì)酸水解后的薏苡仁多糖的單糖組成進(jìn)行分析。[結(jié)果]研究建立了穩(wěn)定可靠的薏苡仁單糖組成分析方法，發(fā)現(xiàn)薏苡仁多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成，其中葡萄糖所占比例最高，并初步分析了7種單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的薏苡仁存在的差異較大。[結(jié)論]研究方法專屬性強(qiáng)，可為薏苡仁藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 薏苡仁多糖;HPLC-UV;單糖組成

中圖分類號(hào)? R284??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào)? 0517-6611（2019）24-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.053

Analysis of Monosaccharide Composition of Polysaccharides from Coix Seeds of Different Origins

WANG Kui-long，CAO Gang， HE Shuai-ying

（School of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou，Zhejiang 310053）

Abstract? [Objective]The research aimed to analyze the monosaccharide composition of polysaccharides from coix seeds of different origins.[Method]The crude polysaccharide of coix seed from different origins was obtained by water extraction and alcohol precipitation， and the content of polysaccharide in each sample was determined by phenol-sulfuric acid method. The monosaccharide composition of acid hydrolyzed coix seed polysaccharide was further analyzed by HPLC-UV method.[Result]A stable and reliable method for the analysis of monosaccharides in coix seed was established. It was found that the polysaccharides in coix seed consisted of mannose， rhamnose，glucuronic acid， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose. The proportion of glucose was the highest， and the mass fractions of seven monosaccharides were preliminarily analyzed. It was found that coix seed from different habitats had great differences.[Conclusion]The method is specific and can provide basis for quality control of coix seed.

Key words? Coix seed polysaccharide;HPLC-UV;Monosaccharide composition

基金項(xiàng)目? 浙江省公益性應(yīng)用計(jì)劃項(xiàng)目（2017C33174）。

作者簡(jiǎn)介? 王奎龍（1989—），男，江蘇泰州人，助理研究員，博士，從事中藥炮制與質(zhì)量控制研究。*通信作者，研究員，博士，從事中藥研究。

收稿日期? 2019-09-02

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen（Roman.）Stapf的干燥成熟種仁，具有利水滲濕、健脾止瀉、解毒散結(jié)的功效，臨床常用于水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉等病征[1-2]。現(xiàn)代研究表明薏苡仁中主要含有蛋白質(zhì)、油脂、多糖三大類成分，其中薏苡仁多糖具有降低血糖[3]、提高免疫力[4]、抗腫瘤[5]等多種活性功能。但關(guān)于該類成分如何發(fā)揮其藥效的作用機(jī)制研究目前仍不清楚，因而開展關(guān)于薏苡仁多糖中單糖組成分的分析，對(duì)于闡明薏苡仁多糖藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)極為重要。

單糖組成分析是多糖結(jié)構(gòu)解析中最基礎(chǔ)、最重要的環(huán)節(jié)，由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，多糖的單糖組成分析一般需要經(jīng)過(guò)多糖的降解、單糖的結(jié)構(gòu)修飾、單糖的分離檢測(cè)三大步[6-8]。該研究通過(guò)優(yōu)化工藝富集得到薏苡仁多糖，采用酸水解的方法得到單糖，經(jīng)過(guò)衍生化后采用HPLC-UV的方法研究薏苡仁多糖的單糖組成，為薏苡仁物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供借鑒。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 試材。

薏苡仁購(gòu)自市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡寶昌教授鑒定為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen（Roman.）Stapf的干燥成熟種仁。三氟乙酸、氫氧化鈉、甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、苯酚、硫酸及各單糖對(duì)照品均為分析純，乙腈、PBS緩沖液為色譜純。

1.1.2? 儀器。

Waters2695液相色譜儀（Waters）;Waters2849紫外檢測(cè)器（Waters）;Empower色譜工作站;FW80-I高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;BOS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP211D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;UNIQUE-S15型RO-DI實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（銳思捷科學(xué)儀器有限公司）。

1.2? 溶液的配制

2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液：取6.192 mL 99% TFA，超純水定容至40 mL;單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，超純水定容至1 mL，即2 mg/mL;混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取每個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，超純水定容至5 mL，即2 mg/mL;0.3 mol/L NaOH 溶液：取0.12 g NaOH粉末，超純水定容至10 mL;10%PMP甲醇溶液：取1.5 g PMP溶于15 mL甲醇中;0.3 mol/L HCI溶液：取濃鹽酸0.3 mL，定容到12 mL。

1.3? 多糖含量的測(cè)定

1.3.1? 粗多糖的提取。

將薏苡仁粉碎后過(guò)三號(hào)篩，置于回流提取裝置中，用10倍量的石油醚回流脫脂，過(guò)濾，棄濾液;濾渣加20倍量蒸餾水回流提取2 h，放冷后抽濾取上清液，濾液在9 000 r/min（20 ℃）條件下離心20 min，取上清液;向上清液中加入乙醇至80%，靜置過(guò)夜后1 000 r/min離心10 min，沉淀加少量純水溶解后，凍干得到白色粉末即為粗多糖，再用蒸餾水溶解后，制成供試品溶液，以備后用。

1.3.2? 多糖含量的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測(cè)定，即在試管中加入1 mL蒸餾水、1 mL樣品、1 mL 5%苯酚、5 mL硫酸，混合均勻，冰水浴冷卻10 min，然后沸水浴加熱15 min，結(jié)束后，在冰水浴中冷卻10 min后，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)（對(duì)照品使用葡萄糖，配制濃度0、0.010、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL）。樣品多糖含量=C×D×V/W×100%，式中，C為供試品測(cè)定濃度，D為稀釋因素，V為供試品體積，W為樣品質(zhì)量。

1.4? 單糖組成分析

1.4.1? 多糖水解。

取10 mg左右薏苡仁多糖，溶于1.5 mL的2 mol/L TFA中，于安瓿瓶中充氮?dú)夥饪冢?10 ℃干燥箱水解2 h;取出放冷后，若有不溶物，先離心（12 000 r/min，10 min），而后于60 ℃減壓蒸干，并用約1 mL左右甲醇清洗，蒸干，重復(fù)3次，封口儲(chǔ)存;于用前加1 mL超純水復(fù)溶。

1.4.2? 多糖的衍生化。

取單糖對(duì)照品混合溶液、單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品、超純水200 μL，加入200 μL的0.3 mol/L NaOH溶液，在加入400 μL的10%PMP甲醇溶液，加完后渦旋混勻，于70 ℃水浴45 min，冷卻至室溫，加入200 μL的0.3 mol/L的鹽酸溶液，渦旋混勻，加入1 mL氯仿萃取，渦旋1 min，4 500 r/min離心5 min，然后再10 000 r/min離心5 min，取上清，重復(fù)3次，通過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后HPLC進(jìn)樣分析。

1.4.3? HPLC分析。

流動(dòng)相：乙腈（A）-PBS緩沖液（pH=6.9）（B），等度洗脫：A∶B=15∶85。體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.3.1? 方法學(xué)考察。

線性關(guān)系：配制一系列2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 mg/mL的混標(biāo)溶液，進(jìn)樣20 μL，以峰面積y對(duì)單糖濃度x做回歸計(jì)算，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線;精密度：將混合對(duì)照品衍生化溶液，分別進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算7種單糖的RSD值;重復(fù)性：稱取6份多糖樣品，水解并衍生化后，根據(jù)液相條件下進(jìn)入色譜分析，記錄相應(yīng)峰面積，計(jì)算RSD值;穩(wěn)定性：精密吸取供試品溶液20 μL，分別記錄0、1、2、3、4、8、12 h 的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.4.3.2? 樣品測(cè)定。

稱取薏苡仁多糖樣品，分別按“1.4.1”“1.4.2”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定;按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中7種單糖的含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 7批次樣品多糖含量分析

由圖1可知，在所選波長(zhǎng)和葡萄糖濃度范圍內(nèi)，吸光度Y與葡萄糖濃度x呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，獲得回歸方程：y=3.784 5x+0.039 9（R2=1）。7批次薏苡仁樣品多糖含量測(cè)定結(jié)果見表1，可知不同產(chǎn)地的薏苡仁含量差異較大，其中以20190101批次樣品的薏苡仁多糖含量最高。

2.2? 方法學(xué)考察

2.2.1? 線性關(guān)系考察。

按“1.4.3.1”方法操作，結(jié)果見表1。從表1可看出，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2? 精密度考察。

按“1.4.3.1”方法操作，測(cè)得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD值分別為0.95%、0.55%、0.71%、0.79%、1.33%、0.16%、1.76%，表明精密度良好。

2.2.3? 重復(fù)性考察。

按“1.4.1”“1.4.2”方法制備5份薏苡仁樣品，吸取20 μL進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD值分別為0.24%、1.25%、1.21%、0.38%、0.40%、0.71%、0.63%，表明重復(fù)性良好。

2.2.4? 穩(wěn)定性考察。

按“1.4.3.1”方法操作，，結(jié)果顯示甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD值分別為1.72%、1.76%、0.67%、1.23%、1.01%、0.62%、2.65%，表明穩(wěn)定性良好。

2.2.5? 7批次樣品的單糖組成分析。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線法方案測(cè)定7批次薏苡仁樣品中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量百分比（占7種單糖的比例），結(jié)果見表2。由表2可知，薏苡仁樣品中的葡萄糖含量均為最高，阿拉伯糖含量最低，不同產(chǎn)地的薏苡仁多糖在單糖組成上存在較大差異。含量測(cè)定的HPLC圖譜見圖2～3。

3? 討論與結(jié)論

多糖類成分是中藥中的一大類成分，由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物利用度差，在過(guò)去這類成分并不受重視，但隨著研究的深入，科研工作者們發(fā)現(xiàn)這類成分也具有較好的生理活性作用。如枸杞多糖類成分具有較好的抗腫瘤活性作用，研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對(duì)胰腺癌細(xì)胞bxpc-3、panc-1和aspc-1的增殖具有劑量依賴性，而對(duì)正常細(xì)胞hpde6-c7和lo2幾乎沒有細(xì)胞毒性，并且通過(guò)阻斷MAPK信號(hào)通路和FAK/AKT/GSK-3β信號(hào)通路抑制bxpc-3細(xì)胞的侵襲作用，該研究從細(xì)胞分子水平證實(shí)了枸杞多糖的抗腫瘤活性作用，為枸杞多糖的進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[9]。研究還顯示多糖類成分能夠與人體的腸道菌群產(chǎn)生相互作用，從而達(dá)到維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、改善疾病狀態(tài)的作用。如肉蓯蓉多糖可以促進(jìn)酪乳桿菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的生長(zhǎng)，有利于人體腸道微生物群的形成[10]。

目前已發(fā)現(xiàn)薏苡仁多糖具有治療糖尿病[11]、脾虛水濕不化[12-13]、腫瘤[14]等藥理作用，但關(guān)于薏苡仁多糖結(jié)構(gòu)的研究大多還停留在總多糖的含量測(cè)定方面[15-16]。該研究通過(guò)建立HPLC-UV的分析方法，對(duì)不同產(chǎn)地薏苡仁的單糖組成進(jìn)行了初步分析，研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地薏苡仁種單糖的組成差異較大。但關(guān)于單糖組成的差異與其藥效之間是否存在關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步的研究。

該研究中的方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、精密度高，可用于薏苡仁單糖類成分的含量測(cè)定，可為薏苡仁物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及道地性研究提供借鑒。

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