一例豬繁殖與呼吸綜合征病的診斷

覃燕靈 董建國 王艷午

（1 廣西農墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場， 廣西南寧 530000； 2 信陽農林學院， 河南信陽 464000；3 廣西農墾永新畜牧集團金光有限公司， 廣西南寧 530000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，又稱藍耳病。臨床上以妊娠母豬流產、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡階段豬只的呼吸道癥狀為主要特征。該病于1987 年在美國暴發[1]，1996 年郭寶清等[2]首次從北京地區暴發流行病豬的流產胎兒體內分離到PRRSV，2006 年春夏季首次暴發由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly-pathogentic PRRSV,HP-PRRSV）引起的“豬無名高熱病癥”給我國養豬業帶來了極大的經濟損害[3-4]。2015 年我國暴發由NADC30-like 毒株引起的PRRS，再次嚴重打擊了養豬業[5-6]。

PRRSV 屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，基因組全長約15 kb[7]。由9 個開放閱讀 框（ORF）：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7 組成[8-9]。ORF5 編碼的GP5 是PRRSV 的膜蛋白。該蛋白是變異最大的結構蛋白，成為PRRSV遺傳變異分析的靶基因[10]。本研究通過對一例豬場的疑似PRRS 陽性病例進行實驗室診斷分析，以期為疾病的診斷提供科學的思路。

1 材料與方法

1.1 病料樣品采集

2018 年3 月，駐馬店地區某豬場疑似PRRS 的豬，采集豬肺臟組織，保存于-20℃備用。

1.2 主要試劑

TRIzol 試劑、dNTP Mixture、DL 2 000 Marker、LA Taq DNA 聚合酶、動物總RNA 快速提取試劑盒來自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank 中收錄的PRRS 基因組序列，設計擴增ORF5 的引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物序列ORF5-F：ACCACCGCAGCATCA GACTTCGTT（5'—3'），下游引物序列：ORF5-R：CGGCCGCGACTTACCTTTAGAGC（5'—3'），擴增片段長度為760 bp，退火溫度為60℃。

1.4 組織總RNA 的提取和ORF5 基因的擴增鑒定

采集病豬肺臟組織，用剪刀剪碎，加入少量無菌PBS 并用研磨器研磨成汁，12 000 r/min 離心5 min，取上清按照試劑盒操作說明提取病料組織總RNA。取6 μL RNA 模 板、 12.5 μL 2 ×FastKing One Step RT-PCR Master Mix、1 μL 25×RT-PCR Enzyme Mix、上下游引物各1.25 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL 共25 μL 體系，在儀器內進行擴增。擴增條件為：42℃30 min，95℃3 min；94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，35 個循環；72℃5 min。擴增的PCR 產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 ORF5 基因序列比對和進化分析

將鑒定陽性的PCR 產物進行序列測定，隨后將獲得的序列與PRRSV 代表毒株用DNAStar 進行序列比對并用Mega 進行進化樹的構建。

2 結果

2.1 臨床病變

由圖1 可知，病豬肺臟組織出現典型的間質性肺炎病變，且肺臟萎縮實變，說明豬只肺臟病變嚴重。

圖1 病豬肺臟病變圖

2.2 PCR 鑒定結果

將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示擴增出PRRSV ORF5 基因片段，片段大小為603 bp，說明引起該病的病原為PRRSV。見圖2。

圖2 PRRSV ORF5 基因的擴增

2.3 ORF5 基因進化樹構建

運用軟件MEGA6.0 對獲得的PRRSV ORF5 基因序列和從GenBank 數據庫中下載的23 個國內外參考毒株的ORF5 基因序列構建進化樹。結果如圖3 可知，駐馬店地區流行的毒株為美洲型，屬于NADC30-like 毒株。美洲型毒株進一步分為4 個亞群，分別是以VR-2332為代表的lineage5/sublineage 5.1，以NADC30 為代表的lineage1/sublineage1.9，以CH-1a 為代表的subgroup I 和以JXA1 為代表的subgroup III。

圖3 PRRSV ORF5 進化樹的構建

2.4 ORF5 基因序列必對

利用DNAStar 中的Megalign 軟件對擴增的ORF5毒株與5 株國內外代表毒株進行基因序列同源性分析。由圖4 可知，ZMD 與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%；與經典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%；與NADC30毒株核苷酸同源性最高，為95.9%。

圖4 PRRSV GP5 基因序列比對分析

3 結論和討論

通過臨床癥狀和實驗室檢測結果分析可知，引起豬場發病的是PRRSV NADC30-like 毒株，該毒株于2015年在中國暴發，隨后中國許多地區均發現PRRSV 陽性[11]。河南地區也是發現PRRSV NADC30-like 毒株陽性較早的地區，該病的發生給本地區PRRSV 疫病的防控帶來了嚴重打擊。

GP5 蛋白是PRRSV 的主要結構蛋白，它在病毒的吸附和入侵過程中發揮重要作用。GP5 蛋白同時是變異最大的結構蛋白，為此常作為PRRSV 遺傳進化分析的靶基因[10]。ZMD 毒株與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%，表明ZMD 毒株為美洲型毒株；與經典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%；與NADC30 毒株核苷酸同源性最高，為95.9%，進化樹分析顯示ZMD 與NADC30 和NADC30-like 毒株位于同一分支，這些結果表明ZMD毒株為NADC30 樣毒株。該結果確證該豬場的疫病是由NADC30 樣毒株感染引起。