北冬蟲夏草液體發酵培養基優化試驗?

摘 要：以優化北冬蟲夏草液體培養基為目的，對比分析了不同的碳源、氮源、無機鹽對北冬蟲夏草液體菌絲生物量及多糖的影響。結果表明：與常用北冬蟲夏草液體培養基相比，采用麩皮作為碳源，北冬蟲夏草胞內多糖和胞外多糖含量均較高;有機氮作為氮源的菌絲生物量及胞外多糖含量均優于無機氮源;Zn2+對北冬蟲夏草菌絲體生長影響較大，當培養基中添加質量分數為0.1%的ZnSO4，北冬蟲夏草的生物量為1.45 mg/mL，菌絲體胞內多糖和胞外多糖含量分別是32.91 mg/g和6.48 mg/100 mL。

關鍵詞：北冬蟲夏草;液體發酵;培養基優化

中圖分類號：S567.35 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2019）01-0001-03

Abstract： Cordyceps militaris， which is an ideal substitute for cordyceps， has a variety of active substances and a wide range of pharmacological effects. In this paper， to optimize the culture medium of Cordyceps militaris， we studied the effects of different carbon sources， nitrogen sources and inorganic salts on the culture medium of Cordyceps militaris. Compared with the conventional medium， the results show that： Bran is more appropriate， and the use of bran as a carbon source of intracellular polysaccharide and extracellular polysaccharide content are higher; The organic nitrogen as a nitrogen source in the mycelium of biomass and extracellular polysaccharide content is better than inorganic nitrogen; Zn2+ has a great effect on the growth of Cordyceps sinensis， and the biomass is up to 1.45 mg/mL with 0.1% ZnSO4 added to the medium. The content of extracellular polysaccharide and extracellular polysaccharide in mycelia are 32.91mg/g and 6.48 mg/100mL， respectively.

Key words： Cordycepsmilitaris; liquid fermentation; medium optimization

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris），也稱北蟲草，其成分、藥用價值同冬蟲夏草相似，是冬蟲夏草最理想的替代品，具有抗癌、抗病毒、增強免疫功能和預防心腦血管疾病等作用，且毒性極低，無副作用，是一種及其珍貴的中藥材[1-5]。已有研究表明，北冬蟲夏草液體培養基中，碳源、氮源及其含量是影響菌絲生長的重要因素[6]，如何選用最優碳、氮源顯得尤為重要。研究以優化北冬蟲夏草液體培養基為目的，采用人工培養的北冬蟲夏草菌種，在單因素差別實驗的基礎上，分別以碳源、氮源、無機鹽作為自變量，差樣比較不同條件下北冬蟲夏草液體培養菌絲胞內、胞外多糖及生物量，尋找較優碳源、氮源、無機鹽，為北冬蟲夏草液體培養基的碳、氮源、無機鹽的選取提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 北冬蟲夏草菌種Erly-991，由長沙而立生物科技有限公司提供。

1.1.2 試 劑 葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、

FeSO4·7H2O、CaCl2·H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4和NH4NO3均為分析純試劑;酵母膏和蛋白胨均為生化試劑;玉米粉、麩皮和豆餅粉均為煮沸30 min后4層紗布濾過液。

1.1.3 培養基 固體PDA斜面加富培養基，用于菌種活化培養。種子液體培養基（L）為：KH2PO4 3.0 g，MgSO4 1.5 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，自然pH值。基礎液體發酵培養基（L）為：葡萄糖25.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO4 0.1 g，MgSO4·7 H2O 0.05 g，VBl 0.1 g，pH值6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法 （1）固體培養。將保存的菌種接種于固體培養基，24℃恒溫培養5 d，備用。（2）種子液培養。將活化的菌種接種于種子培養基中，24℃ 120 r/min振蕩培養4～5 d。（3）發酵培養。按4%（體積百分數）的接種量將培養好的液體種子接種到供試發酵培養基中，24℃ 120 r/min，恒溫振蕩培養5 d。

1.2.2 液體發酵培養基的篩選試驗 （1）碳源試驗。基礎培養基中碳源分別用葡萄糖、蔗糖、玉米粉、麩皮代替，質量分數為2.5%，每組設3個重復。（2）氮源試驗。基礎培養基中氮源分別用蛋白胨、酵母浸膏、豆餅粉、麩皮、硝酸銨代替，質量分數為0.2%，每組設3個重復。（3）無機化合物試驗。基礎培養基中分別加入KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2·H2O，每種無機化合物的添加量的質量分數為0.1%，每組設3個重復。

1.2.3 測定方法 （1）菌絲體生物量的測定。發酵液經3層紗布過濾清液，菌絲體用蒸餾水淋洗后，收集菌絲體，置于45℃干燥箱中干燥至恒重，在干燥器中冷卻到常溫，稱重。（2）北冬蟲夏草胞外多糖提取。北冬蟲夏草液體搖瓶發酵，經4層紗布過濾，將得到的濾液進一步用濾紙過濾，取濾液10 mL，加4倍體積的95%乙醇，4℃醇沉24 h，在轉速為3 000 r/min條件下離心12 min，沉淀物為北冬蟲夏草多糖。將上清液于50℃水浴加熱濃縮至5 mL，濃縮液為北冬蟲夏草待測液，于4℃保存。（3）北冬蟲夏草胞內多糖提取。準確稱取干燥的北冬蟲夏草菌絲體1.00 g，加蒸餾水30 mL，于90℃提取2 h，趁熱過濾，濾渣加蒸餾水30 mL，于90℃水浴浸提2 h，合并濾液，定容至100 mL。取溶液10 mL，加4倍體積95%乙醇，4℃醇沉24 h，離心，沉淀物為北冬蟲夏草胞內多糖。取溶液30 mL，加4倍體積95%乙醇，4℃醇沉24 h，離心，取上清液，將上清液于50℃水浴加熱濃縮至5 mL，濃縮液為北冬蟲夏草待測液，4℃保存。（4）多糖的測定。采用苯酚-濃硫酸法。

1.3 數據分析

采用Excel進行數據分析、制作圖表;采用SPSS

進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 供試碳源對北冬蟲夏草液體培養菌絲生物量、多糖含量的影響

由表1可知，以玉米粉和麩皮為碳源時北冬蟲夏草液體培養菌絲胞外多糖含量無顯著差異，但二者顯著高于葡萄糖和蔗糖為碳源時胞外多糖含量;葡萄糖和蔗糖為碳源時胞外多糖含量差異不顯著。胞內多糖以麩皮為碳源時最高，與其他3種供試碳源差異顯著。從菌絲多糖方面考慮，與葡萄糖作碳源相比，以玉米粉作為碳源的胞外多糖含量最高，為30.76 mg/100 mL，提高了239.89%;麩皮作為碳源的胞內多糖含量較高，為50.79 mg/g，提高了590.08%。北冬蟲夏草對蔗糖的利用效果較好，菌絲體生物量達到2.56 mg/mL，提高了28.64%，麩皮次之，為2.29 mg/mL。綜合考慮，采用麩皮作為北冬蟲夏草液體發酵的碳源較適合。

2.2 供試氮源對北冬蟲夏草菌絲液體發酵培養生物量、多糖含量的影響

由表2可知，以酵母膏、豆餅粉和麩皮為氮源時北冬蟲夏草菌絲體胞外多糖含量較高，三者間無顯著差異，顯著高于以蛋白胨和硝酸銨為氮源時北冬蟲夏草菌絲體胞外多糖含量，后兩者間差異不顯著。麩皮為氮源時北冬蟲夏草菌絲體胞內多糖含量最高，與蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、硝酸銨之間差異極顯著。以胞外多糖為目標產物，酵母浸膏作為氮源，胞外多糖含量可達14.26 mg/100 mL，比蛋白胨為氮源的高48.85%;以胞內多糖為目標產物，可以麩皮作為氮源，菌絲體胞內多糖含量為38.57 mg/g，提高了296.40%;以菌絲生物產量為目標產物時，蛋白胨作為氮源含量最高，可達1.99 mg/mL。

2.3 不同無機鹽對北冬蟲夏草菌絲生物量、多糖含量的影響

由表3可知，ZnSO4對北冬蟲夏草胞內多糖的影響大于其他5種無機鹽;KH2PO4、MgSO4、CaCl2之間差異不顯著，且顯著低于FeSO4，而MnSO4顯著低于前三者、產量最少。對北冬蟲夏草胞外多糖的影響而言，6種無機鹽之間沒有顯著性差異。培養基中添加ZnSO4，北冬蟲夏草菌絲體生物量為1.45 mg/mL，菌絲體中的胞內多糖、胞外多糖含量分別是32.91 mg/g、6.48 mg/100 mL。從北冬蟲夏草菌絲體生物量和胞內多糖含量綜合考慮，可選擇ZnSO4作為北冬蟲夏草菌絲體液體發酵的無機鹽。

3 結論與討論

通過對北冬蟲夏草液體發酵培養基配方的優化，與常用北冬蟲夏草液體發酵相比較，在碳源方面，采用蔗糖生物量可以提高28.64%;以玉米粉作為碳源可提高胞外多糖239.89%;以麩皮作為碳源可提高胞內多糖590.08%，綜合看來以麩皮為好。在選擇氮源時多以胞外多糖為目的，采用酵母膏胞外多糖提高了48.85%;以麩皮作為氮源可提高胞內多糖296.40%，總體上有機氮源優于無機氮源。無機鹽以添加ZnSO4能

得到較優效果，其生物量、胞內多糖、胞外多糖含量

能分別為1.45 mg/mL、32.91 mg/mL和6.48 mg/100mL。

對碳氮源的篩選結果表明：北冬蟲夏草可利用的碳氮源比較廣泛，對碳源來說，北冬蟲夏草對雙糖、單糖等有機碳源有較好利用;對于氮源來說，北冬蟲夏草對有機氮源和天然氮源的利用較好。但是，胞外多糖含量不隨生物量的增加而增加，且兩者間相關性不明顯。另外，適量的無機鹽可以促進北冬蟲夏草菌絲體的生長和胞外胞內多糖的積累，但是，研究僅對培養基進行了優化，要提高北冬蟲夏草多糖、北冬蟲夏草素的含量，還必須對培養條件，包括培養溫度、時間、轉速、裝液量、起始pH、接種量等因素進行優化，還有待于進一步研究。

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（責任編輯：夏亞男）