纖維素分解菌酶活測定空白處理方法的改進

王進軍，沈 謙，曹慧慧，薛 藩

實驗教學研究

纖維素分解菌酶活測定空白處理方法的改進

王進軍，沈 謙，曹慧慧，薛 藩

（揚州大學 環境科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

在酶活測定過程中空白酶活的正確測定具有非常重要的意義。該文以纖維素分解菌的酶活測定為例，介紹了目前處理空白樣品的3種主要方法，并經過對比研究，提出目前最佳的空白處理方法為滅活酶液+底物空白，并進一步優化為離心+滅活酶液+底物空白的方法。面對本科生的該綜合性實驗，將微生物學和生物化學的實驗技術相結合，大大提高了學生的實驗技能。

纖維素分解菌；空白酶活；空白處理

1 纖維素空白酶活測定的必要性

纖維素分解菌酶活的測定能夠直觀精確地判定某種微生物分解纖維素能力的大小。康紀婷[1]整理發現，測量纖維素酶活一般有CMC-Na法和FPA濾紙法。值得注意的是，纖維素酶并不是一種特定的酶，而是由內切葡萄糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶組合而成的復合酶[2]。CMC-Na法主要測定的是菌株產生內切葡萄糖酶的能力，因為內切葡萄糖酶可以直接分解羥甲基纖維素納從而產生還原糖，CMC-Na法測定出的酶活并不能代表菌株的酶活，但對整個菌株的酶活有參考意義；因為FPA法分解的是濾紙，其主要成分是纖維素，纖維素分解菌在分解濾紙的過程中是內切葡萄糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶3種酶相互協同分解的結果[3-4]，所以FPA法測出的酶活更能代表菌株整體分解纖維素的能力。

這兩種方法在測定過程中均要進行空白測定。傳統上由于研究者可能采取不同的空白處理方法，使得同一樣品的空白值的測定結果不準確、且不具有可比性。因此，在用上述兩種方法進行酶活測定時，空白對照組的設置非常關鍵。因為如果各實驗室采取的空白設置各不相同，測定方法不一，測量結果就不具有可比性，也就無法判斷酶活的精確數值。另一方面，不同的空白設置對空白值的影響很大。例如，有些空白設置簡單而單一，未排除所有可能影響酶活測定的因素，若不能有效地設置空白對照組，將會對酶活的測定產生很大影響。因此，設置空白對照組的目的就在于準確地測出空白值[5]，再根據實際值=測量值-空白值，就能夠準確地測量一株纖維素分解菌的酶活力。綜上，通過規范空白組設置，即可避免國際理論和應用化學協會(IUPAC)[6]對纖維素酶活測定過程無明確空白要求而產生的實驗誤差，從而使各實驗室測量的酶活結果具有可比性。

2 空白設置的思路、方法

2.1 思路、方法

采用CMC-Na法測定纖維素酶活時，取0.5 mL菌液加到1.5 mL的 CMC-Na試劑中，在50 ℃條件下水浴30 min，然后加入1.5 mL的DNS試劑，沸水浴5 min后立即冷卻，用蒸餾水定容至25 mL后在520 nm波長處測吸光度[7]。采用FPA濾紙法測定纖維素酶活時，將1.5 g的濾紙加到0.5 mL的菌液中，在50 ℃條件下水浴30 min，然后加入1.5 mL的DNS試劑，沸水浴5 min后立即冷卻，用蒸餾水定容至25 mL后在520 nm波長處測吸光度[8]。

實驗原理為，纖維素分解菌在適宜的條件下分解CMC-Na或者濾紙產生還原糖，沸水浴時還原糖將DNS試劑還原[9-10]，呈現出顏色的變化。在此實驗過程中，任何外來的還原糖都會改變酶活力的測定結果。在用濾紙法測定酶活力時，除了分解菌分解濾紙產生的還原糖，還原糖的來源可能還有菌液中自帶的和濾紙中自帶的。因此，空白處理有以下3種設置方法：底物空白、酶液空白和滅活酶液+底物空白。

2.2 底物空白

底物空白就是在上述實驗過程中不加入CMC-Na或濾紙，而是以等體積的蒸餾水代替CMC-Na或濾紙[9]，再加入一定量的菌液，然后按照相同的實驗步驟測出底物空白的吸光度。因為沒有原料可以被纖維素分解菌分解，水浴溫度又不足以殺死分解菌釋放細胞物質，所以底物空白測出的還原糖只能來源于菌液中自帶的還原糖。

2.3 酶液空白

酶液空白就是將上述實驗中的菌液用等體積的蒸餾水代替，再按相同的實驗步驟測出酶液空白的吸光度。因為沒有任何纖維素分解菌分解CMC-Na或濾紙，水浴溫度又不足以殺死分解菌釋放細胞物質，所以酶液空白測出的還原糖只能來源于CMC-Na溶液或濾紙。

管斌[11]等人研究發現，以蒸餾水作空白測定濾紙酶活時，空白酶活為6.53 U/mL；以底物作空白測定濾紙酶活時，空白酶活為4.48 U/mL[12]，空白對酶活測定的差異率達31.4%，使得纖維素酶活的測定值失去了可比性[11]（見表1）。

表1 不同空白實驗對酶活力測定的影響

這說明用CMC-Na法測定纖維素分解菌酶活，當以蒸餾水和底物作空白時，空白對酶活的差異率為1.4%，可以忽略不計；用FPA法測定纖維素分解菌酶活時，選用酶液空白測定纖維素分解菌空白酶活時，空白酶活的數值將會出現較大偏差，從而影響纖維素分解菌酶活的真實值。

2.4 滅活酶液+底物空白

這種空白處理就是先將待測菌液作滅活處理，再按照上述底物空白的方法進行處理。目前對菌液的滅活有兩種方法。一是將菌液在沸水中殺菌5~25 min，另一種是將菌液放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min[13]。在鄒水洋[14]等人的研究中，100 ℃滅酶活與121 ℃滅酶活相比，會產生較大的負偏差，即偏差程度與保溫時間成負相關[14]。在其測定的對象中，酶樣A的負偏差為9.2%~31.0%，酶樣B的負偏差為13.8%~29.7%[14]（見圖1）。這說明菌液中含有的纖維素分解酶具有較高的耐熱性，在沸水浴中殺菌5~25 min后仍具有部分酶活力；而121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后則可徹底滅菌[15-16]。兩種滅菌方法的比較如表2所示。

圖1 滅酶活時間對酶活力測定的影響

表2 100℃和121℃滅菌的優缺點

因此，如果需要精確地測定酶活力，應選用高壓蒸汽滅菌法，如果是簡單比較兩株菌酶活的高低則可選用沸水浴滅菌法。而不論用哪種滅菌法，滅菌完 成后的菌液中的還原糖只能來源于菌液中自帶的還原糖或（和）纖維素分解菌在滅活時細胞裂解釋放的還 原糖。

2.5 3種空白測定方法比較

綜上所述，3種空白測定方法的優缺點如表3所示。

表3 3種空白酶活測定方法比較

2.6 離心+滅活酶液+底物空白

根據以上3種空白處理方法的對比，滅活酶液+底物空白方法能夠將菌液中自帶的還原糖和濾紙中的還原糖計算在內，是誤差最小的空白處理方法，也是目前測量纖維素分解菌酶活時最常見的空白處理方法，但在滅菌過程中細胞裂解產生的還原糖卻被忽略。因此提出先將菌液進行離心處理，再進行滅菌處理的空白處理方法。

實驗步驟為，先將菌液在13 770 r/min的高速離心機上離心10 min，然后將離心后的菌液高壓滅菌 20 min，最后加入CMC-Na或濾紙，在50 ℃條件下水浴30 min后，加入DNS試劑測量吸光度。

這種空白測定方法，不僅能保留菌液中本身存在的還原糖，而且經過高速離心后，絕大部分的纖維素分解菌沉淀在離心管底部，吸取上清液再進行滅菌時，即可排除由于細胞裂解產生的還原糖對空白測定的干擾。此時還原糖的來源只有菌液本身和濾紙，是誤差最小的空白處理方法。

本實驗設置了5組不同的處理酶液的方法加以驗證：（1）不經過處理的粗酶液；（2）離心（13 770 r/min，離心10 min）后的酶液；（3）121 ℃滅菌后的酶液；（4）121 ℃滅菌后又經離心處理（13 770 r/min，離心10 min）的酶液；（5）先離心處理（13 770 r/min，離心10 min）后121 ℃滅菌的酶液。經過與CMC-Na反應后的吸光度數值如圖2所示。

圖2 五組樣品吸光度對比

第4組與第5組的滅菌和離心順序不同，目的在于尋找這兩種方法的差異性。結果顯示，與第5組相比，第4組多出了在滅菌時細胞裂解釋放的還原糖，吸光度略大；與第3組相比，第4組少了部分可能黏附在細胞體上的還原糖，吸光度略小。第5組樣品的酶液吸光度最小，為0.072，比第3組的0.092高出27.8%，說明菌液經過121 ℃滅活后，菌種釋放的一定量的還原糖物質溶解在菌液中；而菌液經過離心處理后，只有極少量的菌種存在于菌液中，所以經過高壓滅菌后溶解在菌液中的還原糖物質更少。

本實驗初步驗證了先離心再滅菌空白處理（方法5）的可行性，并說明空白處理方法的誤差最小。

3 教學實踐

本實驗是我校環境科學與工程學院實驗教學中心為本科生設計的綜合性實驗項目。項目承接環境微生物學實驗和基礎生物化學實驗兩門課程，是對其內容的延伸。在這兩門實驗課程中，學生分別構建了從不同環境樣品中篩選出的具有纖維素酶活的微生物，并測定了纖維素酶活。本實驗項目是在以上實驗基礎上，發現并解決在測定酶活過程中的空白處理問題，是對學生了解、掌握并綜合運用所學課程知識的一次鍛煉和檢驗，并通過實驗完善了知識體系。

該實驗持續時間較長，因此需合理安排時間，實驗原理講解應穿插在實驗期間的滅菌和離心過程的間隙進行。

4 結語

本研究在濾紙法測定纖維素分解菌酶活時，確定了以121 ℃滅活酶液+底物空白為最佳空白處理方法，可同時排除菌液和濾紙中所含還原糖對實際酶活測定結果的影響。在此基礎上又作了進一步優化，即提出了離心+ 121 ℃滅菌+底物空白處理方法，為進一步精確測定酶活空白值提供了新的方法，同時使不同實驗室、不同菌種之間酶活的測定結果具有了可比性。

該實驗融合了微生物培養技術、生化分析技術和微生物生長特性分析等方面的技能，使學生提升了多學科知識綜合運用能力，強化了實踐技能和創新能力，開闊了視野，激發了參與實驗和科研的積極性和主動性。

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Improvement of blank treatment method for determination of cellulose-decomposing bacteria enzymatic activity

WANG Jinjun, SHEN Qian, CAO Huihui, XUE Fan

(College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

It is very important to determine the blank enzymatic activity correctly in the process of enzymatic activity determination. By taking the determination of cellulose-decomposing bacteria as an example, this paper introduces three main methods of treating blank samples at present, and through comparative study, and puts forward that the best blank treatment method at present is inactivated enzyme solution + substrate blank. The method of centrifugation + inactivated enzyme solution + blank substrate is further optimized. Faced with the comprehensive experiment of undergraduates, the experimental techniques of microbiology and biochemistry are combined, which greatly improves the students’ experimental skills.

cellulose-decomposing bacteria; blank enzyme activity; blank treatment

G642.0; Q936

A

1002-4956(2019)12-0154-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.12.036

2019-03-29

國家自然基金面上項目（81873877）；教育部留學回國人員科研啟動基金項目（20151098）；揚州大學高層次人才科研啟動基金、本科專業品牌化建設與提升工程項目（ZYPP2018C017）；揚州大學“青藍工程”、教改課題（YZUJX2016-37C）

王進軍（1979—），男，江蘇海安，博士，副教授，長期從事“環境微生物學”理論課及實驗課教學工作。E-mail: wangjinjun@yzu.edu.cn