豬圓環病毒病抗體高敏熒光免疫層析快檢試劑盒的研制

王澤洲，吳俊清，章健，陳弟詩，張毅，賀冬梅

(1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

豬圓環病毒?。≒CV-2）是由圓環病毒2型引起的一類免疫抑制性傳染病，該病伴隨著藍耳病、非典型豬瘟等并發或繼發，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失［1-2］。目前對該病的診斷主要采用PCR、間接免疫熒光試驗（IFA）和免疫組織化學染色法（IHC）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金技術等方法［3-5］，這些方法在生產實際中都不同程度地受到條件制約。為達到在基層和養殖場實現快速即時檢測，本研究應用鑭系元素作熒光標記物，研制了一種既具有金標層析技術簡單方便、快捷，又具有ELISA 準確、特異、敏感的豬圓環病毒抗體高敏熒光免疫層析快速檢測試劑盒（PCV-2-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 PCV-2 表達蛋白抗原、兔抗雞IgY 抗體、雞IgY抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608 熒光儀；吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機、點膜和噴金膜機，其他試劑均為國產分析純。豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的陽性血清，豬圓環病毒II型抗體ELISA檢測試劑盒。

此外，制備包被膜、抗原標記微球、夾心法建立等均參照說明書或按相關要求操作。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環境下，把吸水紙、標記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存備用。

1.3 特異性試驗 以建立的判斷標準（標準曲線）與CSFV、PRRSV、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV陽性血清進行豬圓環病毒病抗體鑭系熒光免疫層析檢測，同時設豬圓環病毒抗體陽性、陰性對照，旨在確定該檢測方法是否發生交叉反應。

1.4 敏感性試驗 將PCV-2 標準陽性血清進行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384倍比稀釋，每個稀釋度平行做4個重復，用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒檢測，將結果換算成S/P值，判斷抗體檢出效價。

1.5 重復性試驗

1.5.1 批內重復性試驗 在相同條件下選取12份PCV-2抗體水平不同的血清樣本，每份樣本平行做8個重復，用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒檢測（批號為20170626），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.5.2 批間重復性試驗 在相同條件下選取12份PCV-2 抗體水平不同的血清，分別用4 批PCV-2-LFICA試劑盒檢測（批號分別為20170626、20170718、20171011、20171219），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.6 比較試驗 分別用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒和豬圓環病毒2型抗體ELISA試劑盒同時檢測同一批臨床樣品200 份，比較兩種方法檢測結果的符合率。

1.7 試劑盒的組裝及保存期試驗 PCV-2-LFICA 試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PCV-2-LFICA各個優化條件，對PCV-2陽性和陰性參考血清進行檢測，并對結果進行統計學分析。

1.8 應用試驗 用PCV-2-LFICA試劑盒對收集自四川省內各地的2 372 份血清樣本進行檢測，了解PCV-2血清抗體陽性率。

2 結果

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 標記量的選擇 把標記好的質量比（抗原/微球）不同的熒光微球稀釋相同倍數，組裝成檢測卡，在檢測卡加樣孔中分別加入80 μL 參考樣本，室溫下層析15 min，檢測，考察并驗證不同標記量對標記結果的影響。結果表明，隨標記抗原濃度的增加，各濃度點的結合率呈現先增后降的趨勢，在抗原/微球的質量比為1∶25 時有最大值。因此，選擇標記比例為1∶25的免疫微球進行后續實驗。

2.1.2 加樣量的選擇 在其他條件一致的情況下，考察并驗證樣本不同稀釋倍數對檢測結果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入稀釋10、20、30、40、50、60、70 倍的參考樣本，室溫下反應15min后檢測。結果表明，隨稀釋倍數的增加，各濃度點的結合率均減小。當樣本稀釋倍數為40倍時，繼續降低稀釋倍數，結合率增加不明顯，免疫反應基本飽和。因此，后續實驗選擇樣本稀釋倍數40倍為加樣量。

2.1.3 檢測時間的選擇 在檢測卡加樣孔中加入80 μL參考樣本，室溫下反應，分別在5、10、15、20、25、30 min 時檢測，考察不同檢測時間對結果的影響。結果表明，隨著檢測時間的延長，各濃度點的結合率基本呈現增加的趨勢，試紙靜置15 min 檢測時即能達到較高的結合率，而隨著檢測時間的增加，各濃度點的結合率不再發生較大的變化，趨于平穩，說明在15 min 時試紙條上的雙抗原夾心吸附基本達到飽和。因此，本著快速簡便的原則，選擇檢測時間為加樣后15 min。

2.2 檢測結果的判讀 加樣后，由于液體向前移動，先后與包被在T 線和C 線上的抗原形成復合物，這時試紙條經熒光檢測設備掃描顯示出2 條熒光帶（圖1）。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應的檢測結果以濃度為橫坐標，熒光值信號為縱坐標，經對數函數數據處理程序擬合得到標準曲線（圖2）。當樣本為陰性時，PCV-2抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測不到；當樣本為陽性時，PCV-2 抗體濃度越高，T 線熒光值也越高。無論結果是陽性還是陰性，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現，無論T 線有無，結果均判為無效。

圖1 熒光微球免疫層檢技術檢測PCV-2抗體的掃描圖譜

圖2 熒光微球免疫層析技術檢測PCV-2抗體的標準曲線

2.3 特異性試驗 本次用PCV-2 蛋白抗原和全病毒建立的PCV-2-LFICA 試劑盒檢測7 種常見豬病的陽性血清，得到的熒光比值均低于0.40（見表1），呈陰性反應。表明該方法與7 種常見豬病的陽性血清不發生交叉反應，顯示出很好的特異性。

2.4 敏感性試驗 選取3 份豬圓環病毒2 型抗體強陽性血清進行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384 倍比稀釋，然后做敏感性比對試驗。分別用高敏熒光免疫分析法與酶聯免疫吸附試驗檢測同一份血清，得出PCV-2-LFICA 試劑盒的檢測滴度為1∶64，而ELISA 為1∶4，前者比 后 者 高1～2 個 滴度。表 明 PCV-2-LFICA 試劑盒的敏感性較好。

2.5 重復性試驗 批內重復性試驗的變異系數小于10%（表2），批間重復性試驗的變異系數也小于10%（表3）。表明PCV-2-LFICA試劑盒具有良好的重復性。

2.6 比較試驗 用PCV-2-LFICA試劑盒檢測臨床樣品200份，得出177份陽性，20份陰性，3份可疑；用酶聯免疫吸附試驗檢測200份臨床樣品，得出33 份陰性，167 份陽性。兩種檢測方法的總符合率為91%（表4）。

2.7 保存期試驗 如表5所示，PCV-2-LFICA試劑盒在保存480 d后檢測陽性血清、陰性血清，其變異系數均小于10%，說明該診斷試劑盒在保存12個月后仍然穩定有效，進一步的穩定性試驗還在進行中。

表1 特異性試驗結果

表2 批內重復性試驗結果

表3 批間重復性試驗結果

表4 比較試驗結果

表5 保存期試驗結果

2.8 現場應用試驗 使用本次研制的PCV-2-LFICA 試劑盒檢測收集自四川省內各地的2 372份血清樣本，結果檢出血清抗體陽性1 822份，陽性率為76.8%。

3 結論與分析

3.1 鑭系熒光免疫層析方法（LFICA）是在時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術，它集合了酶標記技術、放射標記技術和同位素標記技術的優點，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好、無污染，且測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和無放射性等優點。在人醫學界已有文獻報道，在獸醫學領域才起步，需要研究的內容和范圍還很多［6］。與國內ELISA 試劑盒檢測結果的符合率和敏感性都在90%以上，說明該方法完全可以用于PCV-2免疫抗體的檢測。

3.2 豬圓環病毒病是一種免疫抑制性疾病，本身可以引起豬群發病和死亡，同時也可以潛伏在機體中，當環境條件改變或有藍耳病、豬瘟、副豬嗜血桿菌病發生的時候，出現繼發或并發感染，使豬群發病率和死亡率增加，給養豬業造成巨大的經濟損失［7-10］。在圓環病毒病抗體的常用檢測方法中，ELISA是目前應用最廣、發展最快的免疫檢測方法，也是當前檢測豬圓環病毒病抗體的主要方法，該法具有敏感性高、特異性強、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優點，但需要比較完備的實驗設備，操作人員需要具有一定的專業技術和經驗，檢測一批樣品的整個流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫站和中小養殖場不適用。間接免疫熒光試驗(IFA)和免疫組織化學染色法(IHC)、PCR 等方法，也都需要專門的實驗室、儀器設備和專業技術人員，并且成本較高。膠體金免疫層析法（GICA）是近年來發展起來的一種快速檢測方法，該方法操作簡單，使用方便，不需要特殊儀器設備，肉眼直接觀察和判定結果，全程只需要幾分鐘，但敏感性較差、重復性不高，產品質量參差不齊，漏檢率和誤診率較高。本研究建立的PCV-2-LFICA 法，既具有膠體金免疫層析法簡單方便、適于基層等優點，又具有ELISA敏感、特異、微量等優點，檢測時間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要具有經驗的專業人員，檢測設備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫部門和養殖場的技術人員。