卵巢上皮性癌中RNA結合基序蛋白3及環氧化酶-2的表達與意義

曾丹，華金仁，安云婷（通信作者）

江西省婦幼保健院 （江西南昌 330006）

卵巢上皮性癌是一種婦科常見惡性腫瘤，易轉移至腹腔內，具有較高的病死率。卵巢上皮性癌的發生、發展、轉移與心血管的生成密切相關。有研究指出，環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）與腫瘤的新生血管生成之間有密切的關系[1]；RNA結合基序蛋白3（RBM3）可通過改變細胞微小RNA水平進而控制球蛋白表達水平，從而影響腫瘤的發生、進展[2]。本研究通過采用免疫組化法檢測卵巢上皮性癌中RBM3和COX-2的表達，探討RBM3和COX-2在卵巢上皮性癌診斷中的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月至2019年5月江西省婦幼保健院收治的卵巢上皮性癌患者100例，同時選取同期的良性卵巢上皮性腫瘤患者和正常卵巢組織患者各100例，所有患者的石蠟組織標本均經手術病理學確診。卵巢上皮性癌組年齡24～79歲，平均（51.51±3.35）歲；良性卵巢上皮性腫瘤組年齡24～78歲，平均（50.48±3.26）歲；正常卵巢組織患者年齡23～78歲，平均（51.26±3.41）歲。3組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。患者均知曉研究內容并自愿簽署知情同意書。

排除標準：合并重癥肝腎功能障礙的患者；不能配合研究的患者。

1.2 方法

3組均采用免疫組化法檢測RBM3和COX-2。

COX-2檢測：采用二步法行免疫組化染色，使用上海研生生化試劑有限公司提供的COX-2兔抗人單克隆抗體及即用型快速免疫組化MaxVisionTM 試劑盒；石蠟切片厚度4 μm，用二甲苯對切片行脫蠟處理，用梯度乙醇行脫水處理，對抗原進行高溫修復，用PBS緩沖溶液沖洗，放置于濕盒；分別滴加抗COX-2，在37 ℃下孵育1 h后用PBS沖洗；之后滴加MaxVisionTM 試劑，在37 ℃下孵育15 min，用 PBS沖洗；然后用DAB染色4 min，之后用自來水沖洗；用蘇木素復染，最后用自來水沖洗返藍；用梯度乙醇沖洗至透明后封片。

RBM3檢測。（1）蠟塊篩選：從玻片庫挑選具體病例的玻片，于顯微鏡下篩查，挑選最佳免疫組化玻片，標記并登記詳細的玻片信息；之后挑選蠟塊庫中對應蠟塊，按照規范要求制作組織切片。（2）高壓抗原修復方法：先經二甲苯做脫蠟處理常規組織玻片，之后放入梯度乙醇脫水，并放入到蒸餾水中，留作備用；取pH值為6.0的檸檬酸緩沖液800～1 500 ml，放入壓力鍋內，加熱直至壓力鍋沸騰；預先經過脫蠟處理的切片置于不銹鋼切片架上，放入已經煮沸的緩沖液中；再次加熱至噴氣，計時1～2 min后冷卻至室溫，取出玻片，蒸餾水沖洗2次；用pH值為7.2～7.4的PBS沖洗2次，每次3 min。（3）免疫組化染色：切片脫蠟后，沖洗干凈，放入塑料欄，用蒸餾水沖洗1遍，倒入檸檬酸液，放入微波爐中行抗原修復；取出后冷卻15 min，倒掉檸檬酸液，用蒸餾水沖洗1遍，在試劑盒中畫圈，后用 PBS沖洗1遍，滴加過氧化氫，室溫下孵育10 min；用PBS沖洗 3 min×3遍，去掉 PBS 液，切片加一抗；于室溫環境下進行為期4 h的孵育；PBS沖洗 3 min×3遍，加增強劑 A，室溫下孵育20 min；PBS 沖洗3 min×3遍，加二抗，室溫下孵育30 min；PBS 沖洗3 min×3遍，甩去 PBS 液，切片加100 μl或2滴DAB；PBS 沖洗1 min×3遍后，用蒸餾水沖洗、蘇木素復染，之后用0.1%鹽酸分化、自來水沖洗，PBS沖洗返藍；用蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、干燥，用中性樹膠做封片處理。

1.3 臨床評價

比較RBM3和COX-2在3組中的表達情況。陽性標準：RBM3染色胞核出現棕黃色顆粒判定為陽性細胞；COX-2免疫組化反應物質均位于細胞質，在400倍光鏡下至少有10個視野，且陽性細胞數≥10%，判定為陽性。

1.4 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，計量資料以x-±s表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組COX-2陽性率比較

COX-2在卵巢上皮性癌組中的陽性率高于良性卵巢上皮性腫瘤組和正常卵巢組織組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組COX-2陽性率比較

2.2 3組RBM3陽性率比較

RBM3在卵巢上皮性癌組中的陽性率高于良性卵巢上皮性腫瘤組和正常卵巢組織組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組RBM3陽性率比較

3 討論

環氧化酶也稱為前列腺素過氧化合成酶，為前列腺素合成的重要限速酶，主要包括COX-1、COX-2。COX-2是一種細胞因子誘導酶，一般在正常組織中無表達，而在炎癥、腫瘤等一定的誘導條件下可表現為高表達。有研究表明，COX-2的過度表達與卵巢癌、直腸癌、前列腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關[3]。COX-2參與了腫瘤的各種生物學行為，包括促進血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤黏附和轉移、抑制免疫等多個環節。本研究結果顯示，COX-2在卵巢上皮性癌組、良性卵巢上皮性腫瘤組中的陽性率明顯高于正常卵巢組織組，且COX-2在卵巢上皮性癌組中的陽性率明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤組，可見COX-2在正常卵巢組織中不表達，且COX-2在卵巢上皮性癌中的表達高于良性卵巢上皮性腫瘤，提示COX-2的表達升高與腫瘤的分化程度和分期密切相關[4]。COX-2主要在細胞質中表達，初步設想可經免疫電鏡等技術準確定位細胞器種類，并為臨床提供針對性的診治方案。

RBM3是一種富含甘氨酸的蛋白，含有一個RNA識別基序（RBM3），在卵巢癌組織中呈現異常表達，其可能參與了卵巢癌血管的生成，并對卵巢癌的發生、發展具有促進作用[5]。RBM3還被認為是一種潛在原癌基因，主要是因為其表達水平受腫瘤分期的影響，且其發生與腫瘤相關；RBM3沉默可導致G2/M期數量增加，并促使細胞凋亡；RBM3還可提高血管內皮生長因子mRNA、COX-2的穩定與翻譯，mRNA翻譯變化對細胞變化、腫瘤發生起著重要作用；而且RBM3可與mRNA直接結合，起到改變mRNA二級結構的作用，影響核糖體亞基和起始因子的訪問，并調節其激酶活性，影響腫瘤疾病的發生。本研究結果顯示，RBM3在卵巢上皮性癌組中的陽性率明顯高于卵巢良性上皮性腫瘤組和正常卵巢組織組，證實RBM3可通過改變細胞的微小RNA水平和控制球蛋白的表達水平進而影響腫瘤的進展，臨床可根據RBM3水平診斷鑒別卵巢上皮性癌。

綜上所述，RBM3和COX-2在卵巢上皮性癌中呈高表達，因此RBM3和COX-2可作為診斷卵巢上皮性癌的重要生物學指標。