消化離心沉淀涂片法在痰找抗酸桿菌中的應用

周清林，王輝，曾紅平，陳麗紅，唐裕后，許春華，陳旺國

江西省廣昌縣人民醫院檢驗科 （江西廣昌 344900）

肺結核是由結核分枝桿菌復合群引起的慢性傳染性疾病，其發病率和病死率均呈現逐年增加的趨勢[1]，嚴重威脅人類的健康。及早確診并接受規范的藥物治療是肺結核患者治愈的關鍵[2]。痰標本直接涂片法操作簡單、價格低廉，在我國被廣泛用于肺結核的診斷[3]，但其靈敏度低，涂陽患者漏檢現象嚴重，難以滿足新形勢下結核防控策略的需求[4]。本研究運用消化離心沉淀涂片法查找痰液中的抗酸桿菌，就其檢出結果與直接涂片法、熒光染色鏡檢法進行對比分析，以確定該方法的臨床應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月至2019年5月江西省廣昌縣人民醫院送檢的192例痰標本，其中男109例，女83例；年齡15～82歲，平均（54.05±5.66）歲。每份標本同時采用消化離心沉淀涂片法、直接涂片法和熒光染色鏡檢法查找抗酸桿菌。

1.2 方法

本研究所用儀器與試劑包括：奧林巴斯CX23生物顯微鏡、明美生物熒光顯微鏡、GENIUS 6K-C離心機、微型旋渦混合儀，珠海貝索的抗酸染色液、抗酸熒光顯色試劑、4%NaOH溶液。

消化離心沉淀涂片法：吸取痰液2～3 ml于滅菌離心管中，加入1～2倍體積的4%NaOH 溶液，振蕩混勻30～60 s；室溫靜置15～20 min，待檢體完全融化后，3 000 r/min 離心10 min；吸去上清液，混勻管底沉淀物，取沉淀物1滴（約50 μl）于玻片中央，均勻涂成10 mm×20 mm卵圓形痰膜，自然干燥和火焰固定后進行抗酸染色；滴加苯酚復紅2～3滴，加熱3～5 min，待涂片冷卻后水沖洗；3%鹽酸酒精脫色30～60 s，水沖洗；堿性美蘭溶液復染1 min，水洗。

直接涂片法：用竹簽茬端挑取痰標本中干酪樣或膿樣等異常部分0.05～0.1 ml，于玻片正面右側2/3處均勻涂成10 mm×20 mm的卵圓形痰膜；痰膜朝上靜置自然干燥后（一般約需要30 min）[5]，進行抗酸染色。

熒光染色鏡檢法：痰標本用直接涂片法制片，自然干燥后，火焰固定；滴加金胺“O”染液于涂片上，37 ℃染色15 min，水洗；脫色液脫色1～2 min，水洗，直至肉眼觀察無色為止；復染液復染3～4 min，水洗。

1.3 臨床評價

比較3種方法的陽性檢出率，探討消化離心沉淀涂片法在痰找抗酸桿菌中的優越性。染色后鏡檢及結果報告依照《中國結核病防治規劃、痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》規定的標準執行[6]。

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.O統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

消化離心沉淀涂片法、熒光染色鏡檢法陽性檢出率均高于直接涂片法，差異有統計學意義（P＜0.05）；消化離心沉淀涂片法與熒光染色鏡檢法陽性檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 192例標本3種方法陽性檢出率比較

3 討論

有文獻報道，受技術操作等多方面因素影響（如含血液的痰標本、口腔中的雜物、人為染色的差異性等[7]），傳統痰涂片方法陽性檢出率較低，容易出現漏檢。傳統痰涂片檢查中，有40%以上的成人肺結核及75%肺外結核患者的檢查結果為陰性，且傳統痰涂片檢查無法對潛伏期感染做出診斷[8]。而消化離心沉淀涂片法在直接涂片法的基礎上，對痰標本進行消化溶解離心處理，提高了抗酸桿菌的陽性檢出率。消化離心沉淀涂片法主要有以下優點：（1）采用4%NaOH溶液作為溶痰劑消化痰液，既能降低抗酸桿菌的活性，又可殺死非分枝桿菌，避免在涂片染色過程中，因殘存在痰液中的病原菌揮發，危害操作者及周圍人員的健康；（2）4%NaOH溶液可以更加徹底地溶解痰液中上皮細胞、黏液、血液等蛋白成分，有利于菌體的釋放，涂片背景更干凈，鏡檢更加清晰易辨；（3）消化后的痰標本經過離心沉淀，抗酸桿菌集聚于離心管底，實現了菌體的極大濃縮，有利于抗酸桿菌的檢出。

熒光染色鏡檢法使用LED熒光顯微鏡鏡檢，先以20×物鏡、10×目鏡觀察，發現疑似結核分枝桿菌的熒光桿狀顆粒后用40×物鏡確認；暗色背景下，抗酸桿菌呈橙色或黃色閃亮發光，菌體形態稍彎曲，有的有分枝[9]，因此熒光染色鏡檢法診斷性能明顯優于普通的光學顯微鏡。熒光染色鏡檢法在2011年就得到WHO的認可和推薦。但熒光染色鏡檢法的成本在3種方法中最高。在熒光染色條件下，分枝桿菌與某些雜質在鏡下都呈現為同樣的黃色桿狀或短棒狀，而不是萋尼染色條件下的紅色與藍色背景的明顯區分，這對操作者的鏡檢技術水平要求較高，鏡檢技術水平較低的人員可能無法完全辨別分枝桿菌與其他雜質[10]。

本研究結果顯示，消化離心沉淀涂片法具有熒光染色鏡檢法相似的陽性率，而且有5例消化離心沉淀涂片法檢測陽性的標本，熒光染色鏡檢法檢測卻為陰性。這可能是因為消化離心沉淀涂片法對標本進行了消化溶解離心處理，提高了標本中抗酸桿菌的菌量，更容易檢出。有2例熒光染色鏡檢法檢測為陽性的標本，消化離心沉淀涂片法檢測卻為陰性，其原因可能是患者長期服用抗結核藥物，分枝桿菌的抗酸性被破壞，但熒光染色性被保留，因而抗酸染色陰性，而熒光染色陽性。

消化離心沉淀涂片法的操作關鍵：標本量應以2～3 ml為宜，量大則難以消化；把握好離心速度和時間，不宜過慢、過短；涂片時宜薄不宜厚，需自然干燥，不能加熱烤干，否則染色時痰膜容易被流水沖掉，降低鏡檢陽性率。

綜上所述，消化離心沉淀涂片法具有成本低廉、操作簡單、陽性檢出率高的特點。