響應面法優化玫瑰茄花色苷的提取工藝

錢鐳，劉婷，辛雪，姜濤，胡淑敏，屈巖峰，任德財，*

（1.黑龍江東方學院食品與環境工程學部，黑龍江哈爾濱150066；2.黑龍江龍丹乳業科技股份有限公司，黑龍江哈爾濱150086）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.or roselle）是錦葵科木槿屬的一種藥用草本植物，一年生，別名：洛神花、山茄子等，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，目前在我國許多地區如：廣東、臺灣、云南、海南等地均有大規模栽培[1]。玫瑰茄的花萼中富含天然色素花色苷，主要是飛燕草素和矢車菊素結合不同糖苷的物質?；ㄉ帐悄壳皣鴥韧庋芯康臒狳c，既可以食用、泡茶，又具有良好的保健功能和藥用價值，它有清除自由基、抗氧化的優點，在抗癌、抗炎，預防老年癡呆和心血管疾病上有明顯作用[2]。隨著科技的發展，天然色素已慢慢取代了人工合成色素的市場[3]，廣泛應用于飲料、酸奶和糖果等行業[4-5]，對天然色素的提取方法也在不斷優化和更新，常見方法包括：溶劑浸提法、超臨界流體萃取法、微波輔助法等[6-7]。本文采取傳統的溶劑浸提法，對玫瑰茄干花萼中花色苷進行提取，根據“相似相溶”原理，花色苷溶于甲醇、乙醇、丙醇等溶劑，考慮到甲醇具有毒性，故選擇乙醇為提取溶劑[8]。在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法設計四因素三水平的優化試驗，探索最佳的提取工藝條件，為今后玫瑰茄中花色苷的分離、純化提供理論參考[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄干花萼：亳州；無水乙醇、三水合醋酸鈉、氯化鉀（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FW100高速萬能粉碎機：上海書培實驗設備有限公司；SH11YX/UV-8000S紫外-分光光度計：上海陵光技術有限公司；LD5-2B高效離心機：北京京立離心機有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

用高速萬能粉碎機將玫瑰茄干花萼粉碎成玫瑰茄粉，過70目標準篩，在干燥、密閉條件下儲存、備用。

1.3.2 玫瑰茄花色苷的提取

稱取玫瑰茄粉2 g，按一定的料液比加入乙醇溶劑，于恒溫水浴鍋中浸提一定時間。冷卻后以5 000 r/min的速度離心10 min，取上清液備用[10]。

1.3.3 玫瑰茄花色苷波長的測定

花色苷類物質的特征吸收值大約在278 nm和507 nm～536 nm區間內[11]。為方便操作，將花色苷提取液稀釋一定體積，選取在可見光區505 nm～535 nm進行掃描，繪制光譜圖，確定出玫瑰茄花色苷的最佳測定波長。

1.3.4 玫瑰茄花色苷含量的測定

根據馮建光等的研究方法[12]（過程稍作改動），將提取液定容后取1.0mL，分別用氯化鉀緩沖液（0.025mol/L，pH1.0）和醋酸鈉緩沖液（0.4 mol/L，pH4.5）定容至 25 mL的棕色容量瓶中[13]，靜置90 min，以蒸餾水作空白，分別測定溶液在520 nm和700 nm處的吸光度（A），用pH示差法計算玫瑰茄中花色苷的含量，公式如下：

式 中 ：ΔA=（A520pH1.0-A700pH1.0）-（A520pH4.5-A700pH4.5）；DV 為定容的體積，mL；VF 為稀釋倍數；W 為樣品質量，g；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質量，449.2 g/moL；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數，26 900 L/（mol·cm）；L為比色皿寬度，1 cm。

1.4 玫瑰茄花色苷提取工藝的研究

1.4.1 單因素試驗設計

1.4.1.1 乙醇濃度對花色苷含量的影響

稱取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶劑，在60℃下提取60 min。

1.4.1.2 提取溫度對花色苷含量的影響

稱取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，分別在溫度為 40、50、60、70、80 ℃的條件下提取 60 min。

1.4.1.3 提取時間對花色苷含量的影響

稱取 5份玫瑰茄干粉（每份2 g），按料液比1∶25（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，在 60℃下分別提取 30、60、90、120、150 min。

1.4.1.4 料液比對含量的影響

稱取5份玫瑰茄干粉（每份2 g），分別按料液比1∶15、1∶20、1 ∶25、1 ∶30、1∶35（g/mL），加入濃度為40%的乙醇溶劑，在60℃下提取60 min。

1.4.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比4個因素為自變量，花色苷含量為響應值，設計四因素三水平的響應面優化試驗，對玫瑰茄花色苷的提取參數進行優化[14]。

2 結果與分析

2.1 玫瑰茄花色苷波長的確定

玫瑰茄花色苷紫外-可見光譜圖見圖1。

圖1 玫瑰茄花色苷紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-visible spectra of anthocyanins in roselle

如圖1所示，對花色苷提取液在可見光區505 nm～535 nm進行掃描，得到玫瑰茄花色苷的最佳測定波長為520 nm。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 乙醇濃度對玫瑰茄花色苷含量的影響

乙醇濃度對花色苷含量的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對花色苷含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content of anthocyanins in roselle

由圖2分析可知，隨乙醇濃度不斷增大，花色苷含量先增加后減少。當乙醇濃度為40%時，花色苷含量最大為5.102 mg/g。由于花色苷物質表現出較強的極性，若乙醇濃度過高會導致溶液極性弱，從而使提取率降低[15]。因此，玫瑰茄花色苷的最佳乙醇濃度條件為40%。

2.2.2 提取溫度對玫瑰茄花色苷含量的影響

提取溫度對花色苷含量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對玫瑰茄花色苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the content of anthocyanins in roselle

由圖3分析可知，提取溫度在40℃～70℃范圍內，花色苷含量隨著溫度升高而增大，當溫度為70℃時花色苷含量達到最大值5.203 mg/g，若繼續升溫花色苷含量降低。這是由于升溫雖有助于花色苷的溶出，但過高的溫度也會加快花色苷的降解，從而使總花色苷含量減少[16]。同時，乙醇在高溫下易揮發，也是花色苷含量減少的原因之一。

2.2.3 料液比對玫瑰茄花色苷含量的影響

料液比對花色苷含量的影響見圖4。

圖4 料液比對花色苷含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the content of anthocyanins in roselle

由圖4分析可知，料液比大，花色苷提取不充分，溶液體積增大有利于花色苷的溶出，但過大比會稀釋提取濃度，使花色苷含量降低，也會造成提取溶劑的浪費。因此，確定最佳料液比為1∶25（g/mL），此時花色苷含量為5.125 mg/g。

2.2.4 提取時間對玫瑰茄花色苷含量的影響

提取時間對花色苷含量的影響見圖5。

圖5 提取時間對花色苷含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the content of anthocyanins in roselle

由圖5分析可知，隨提取時間的增加，花色苷含量先增大后減小，在90 min時花色苷含量為5.212 mg/g。90 min后花色苷含量下降，這是由于在長時間保溫狀態下，花色苷結構會發生變化或遭到破壞[17]，故選擇最佳的提取時間為90 min。

2.3 響應面法優化花色苷提取工藝

2.3.1 響應面試驗設計及結果

在單因素的基礎上，利用Box-Behnken設計出四因素三水平共29個試驗點的響應面試驗，其中24個析因點分別構成三維頂點，5個零點為區域的中心點[18]。因素水平編碼表見表1，試驗設計和結果見表2。

2.3.2 響應面試驗數據分析

使用Design Expert 8.0.6軟件，以乙醇濃度A、提取溫度B、提取時間C、料液比D為自變量，玫瑰茄花色苷含量Y為響應值，對表2中的數據進行回歸分析，得到方差分析表3，對其數據進行多項式擬合，建立一個回歸方程：

表1 響應面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding table of response surface methodology

表2 試驗設計及結果Table 2 Response surface design arrangement and results

Y=5.28-0.026A-0.021B-0.000 667C+0.007 33D+0.053AB-0.060AC+0.038AD+0.13BC-0.027BD-0.020CD-0.11A2-0.067B2-0.16C2-0.13D2

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

由表3可看出，響應面回歸模型表現為極顯著（P＜0.000 1），有90%的數據可以被方程很好的解釋，說明該模型有良好的擬合性。4個因素對Y值（花色苷含量）的影響大小依次為：乙醇濃度（A）＞提取溫度（B）＞提取時間（D）＞料液比（C）。其中 C2、D2對Y值影響極顯著（P＜0.000 1），BC、A2、B2對 Y 值影響顯著（P＜0.01），與回歸模型預測吻合[19]。該模型中C.V.%為1.08且失擬項顯著，說明模型可較好的反映響應值，試驗操作可信度高。

2.3.3 各因素及其交互作用對花色苷含量的影響

通過Design Expert 8.0.6軟件得到各因素間的等高線圖和響應曲面如圖6～圖11，進一步分析其交互作用對響應值的影響。若等高線形狀為圓形，表示交互作用不顯著；若形狀為橢圓，表示交互作用顯著。響應曲面越陡峭，表示響應值對因素變化的適應性越差[20]。

圖6～圖11可直觀表示出每兩個因素間交互作用對花色苷含量的影響程度。AC、BC的交互作用顯著。其中BC的等高線更接近橢圓，對花色苷含量的影響更加明顯，這與方差分析的結論相一致。由響應曲面觀察可知，AC、AD、BC、CD的曲面坡度較為陡峭，則其因素間交互作用對花色苷含量的影響較大，而AB、BD的響應曲面坡度較為平緩，說明其對花色苷含量影響較小。

圖6 乙醇濃度與提取溫度交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.6 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇濃度與料液比交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.7 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentration and liquid ratio

圖8 乙醇濃度與提取時間交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.8 Contour diagram and response surface of interaction between ethanol concentrationand extraction time

圖9 料液比與提取溫度交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.9 Contour diagram and response surface of interaction between liquid ratio and extraction temperature

圖10 提取溫度與提取時間交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.10 Contour diagram and response surface of interaction between extraction temperature and extraction time

圖11 料液比與提取時間交互作用的等高線圖和響應曲面Fig.11 Contour diagram and response surface of interaction between liquid ratio and extraction time

2.3.4 提取工藝參數的驗證

通過對回歸模型分析得出玫瑰茄花色苷提取的最佳工藝參數為：乙醇濃度38.4%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24.45（g/mL），提取時間91.5 min?；ㄉ绽碚撝禐?.288 mg/g。考慮到實際操作的方便性，最終以乙醇濃度38%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24（g/mL），提取時間91 min為最佳工藝參數，試驗測得花色苷含量為5.285 mg/g，結果與理論值較接近，說明用該方法優化花色苷提取條件有較高的可靠性和可行性。

3 結論

本試驗采取溶劑法提取玫瑰茄中花色苷，并用pH示差法計算花色苷含量。在乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間4個單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken設計四因素三水平的試驗，對玫瑰茄中花色苷的提取工藝進行優化。各因素對提取效果的影響依次為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比。優化后的工藝參數為：乙醇濃度38%，提取溫度66.6℃，料液比1∶24（g/mL），提取時間91 min，該條件下提取液中花色苷含量為5.285 mg/g。此方法科學合理，花色苷的提取效率較高，可為今后的研究和實踐提供理論依據。