葡萄籽多肽制備及其自由基清除能力的研究

李文慧，劉飛，劉江，趙巧玲，董娟，*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什844006；3.新疆賽里木現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，新疆博樂833400）

葡萄在世界上無論是栽培還是產(chǎn)量都在水果里占有很大的比例，全世界葡萄的每年產(chǎn)量大概有6 000萬噸，我國年產(chǎn)量達到200多萬噸，由于對葡萄籽不合理利用和加工，造成了葡萄籽副產(chǎn)物不可避免的浪費[1]。葡萄籽蛋白含有人體8種必需氨基酸，脫脂葡萄籽粕中含有蛋白質(zhì)約13%～16%，而脫殼榨油后的籽粕中蛋白質(zhì)含量高達30%，以酶解的方法能夠水解葡萄籽蛋白并且成功得到葡萄籽活性多肽，多肽分子量很小并且沒有免疫原性、易吸收，同時為我國動植物生物活性多肽的研究提供強有力的理論基礎(chǔ)[2]。

本文通過酶法改性、冷凍干燥制備葡萄多肽，再根據(jù)自由基清除能力、抗油脂氧化酸敗和還原能力的測定，分析葡萄多肽的抗氧化活性；最后通過試驗設(shè)計優(yōu)化工藝流程關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，確定最佳工藝參數(shù)，可提高葡萄籽的附加值，具有較好的發(fā)展前景[3]。不但能夠充分利用新疆優(yōu)越的資源優(yōu)勢，推動多肽食品的開發(fā)，而且還能推動新疆的農(nóng)作物經(jīng)濟發(fā)展，實現(xiàn)資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬干的葡萄籽：瑪納斯縣新天國際葡萄酒業(yè)有限公司。以脫脂葡萄籽粕為原料，采用酶輔助堿溶酸沉法得到脫脂葡萄籽中的蛋白質(zhì)。

石油醚、氫氧化鈉、甲醛、DPPH試劑：天津永晟精細化工有限公司；95%乙醇：烏魯木齊碘伏消毒液有限責任公司；考馬斯亮藍G-250：背景博奧拓達科技有限公司；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）、堿性蛋白酶（＞200 U/mg）：安馳科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小鋼磨粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；ZXRD-7080全自動新型鼓風烘箱：上海智城分析儀器制造有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；Multifuge X3R 離心機：Thermo Fisher scientific；UVmini-1240分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽多肽的制備工藝流程

脫脂葡萄籽蛋白→復合酶解（堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶）→離心→干燥→酶解物（葡萄籽多肽）

1.3.2 水解度的測定

蛋白質(zhì)在水解過程中肽鍵會斷裂生成多肽或游離氨基酸[4]。因此，水解度=游離氨基氮含量/總氮含量。游離氨基氮含量采用甲醛滴定法，總氮含量測定采用凱式定氮法（GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》）。

1.3.3 復合酶解單因素試驗設(shè)計

分別以復合酶質(zhì)量比（0∶10、4∶6、5∶5、7∶3、9∶1、10∶0）、酶濃度（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、pH（6.2、6.6、7.0、7.4、7.8）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）和酶解時間（1、2、3、4、5 h）為影響因素考察其對水解度的影響[5]。

1.3.4 試驗設(shè)計

通過單因素試驗確定了復合酶質(zhì)量比為7∶3，在單因素試驗得到最佳值的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.9.6軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選擇如表1所示的響應面分析法，以水解度為響應值，通過響應面分析對提取條件進行優(yōu)化，選擇出葡萄籽多肽水解度最高的提取條件為最佳提取工藝[6-7]。各因素、水平的正交試驗，因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Response surface factor level

1.3.5 葡萄籽多肽抑制油脂氧化活性的研究

采用最優(yōu)工藝提取出的葡萄籽蛋白多肽，分別溶于葵花籽油中，在65℃強化條件下，定期（每隔2天）測定油脂的過氧化值，相同條件下與VC、VE做對照試驗，觀察葡萄籽蛋白多肽對葵花籽油氧化的抑制作用[8]。

1.3.6 清除DPPH自由基能力的測定[9]

將1 mL不同濃度葡萄籽蛋白復合蛋白酶酶解物與3 mL的DPPH反應，反應平衡時517 nm處測定吸光度，研究其對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為空白吸光度值；A為517 nm下加入樣品的DPPH的吸光度值；Ab為517 nm下不加入樣品的DPPH的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗中每組試驗重復3次，OriginPro8.5進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 復合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響

復合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響見圖1。

圖1 復合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of the ratio of compound enzyme on the degree of hydrolysis of grape seed protein

根據(jù)圖1可知，使用質(zhì)量比為堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=7∶3時，蛋白多肽水解度達到17.93%，當加入堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶時，蛋白多肽被分解為分子質(zhì)量更小的多肽和氨基酸，因此效果最佳[10]。

2.1.2 復合酶濃度的影響

設(shè)定酶解pH7.0、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，考慮不同酶濃度（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 復合酶濃度對水解度的影響Fig.2 Effect of the concentration of complex enzyme on the degree of hydrolysis

由圖2可知，在pH值、酶解溫度、酶解時間一定的情況下，隨著酶濃度的增大，反應速度越快，蛋白質(zhì)水解度也越高，但當酶濃度為2%以后水解度基本不再增加[11-12]。

2.1.3 pH值的影響

設(shè)定酶濃度為2%、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，考慮不同pH值對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酶濃度、酶解溫度、酶解時間一定的情況下，使用復合蛋白酶水解pH 7.4左右時，水解度達到最大，高于或低于此值，酶的活性都會受到抑制[12-14]。

圖3 pH值對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.4 酶解溫度的影響

設(shè)定酶濃度為2%、pH為7.4、酶解時間3 h，考慮不同酶解溫度對水解度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of hydrolysis

酶是具有很強專一性的蛋白質(zhì)，所以只有達到某種溫度時，酶才有最強的活性，當加熱溫度過高時，會導致酶蛋白變性，使酶喪失催化能力。由圖4可知，在酶濃度、pH值、酶解時間一定的情況下，使用復合蛋白酶水解脫脂葡萄籽，酶解溫度50℃時，水解度達到最大[15-18]。

2.1.5 酶解時間的影響

設(shè)定酶濃度為2%、pH為7.4、酶解溫度50℃，考慮不同酶解時間對水解度的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 時間對水解度的影響Fig.5 Effect of time on the degree of hydrolysis

由圖5可知，在前3 h內(nèi)，水解度有一個較快的增加，但是酶解3 h以后再延長酶解時間，水解度基本上不再增加。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇3 h為最佳酶解時間。

2.2 響應面法試驗結(jié)果及回歸方程分析

2.2.1 響應面法試驗方案及結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選定酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）為因素，以水解度為響應值，根據(jù)響應面分析方法，設(shè)計三因素三水平試驗方案，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2，試驗設(shè)計方案共17個試驗點，12個為分析試驗，其余5個為中心試驗（用于估算試驗誤差）。

表2 響應面試驗方案及結(jié)果Table 2 Response plan experiments and results

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression equation

試驗結(jié)果進行多元擬合回歸，得到以葡萄籽蛋白水解度（Y）為因變量，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）為自變量的回歸方程為：Y=23.33-1.23 A+0.30B+2.88C+0.020AB+2.15AC-0.16BC-1.05A2-2.73B2-1.64C2

由表3可知，回歸模型P小于0.000 1，水平為極顯著，能夠正確反映葡萄籽蛋白水解度與各因素之間的關(guān)系，失擬項P值為0.921 1，P＞0.05，表示其不顯著，說明回歸模型與實際實驗擬合較好，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，表明實測值和預測值間有很好的擬合度，此模型調(diào)整R2為0.986 5，表明有98.65%的得率變異分布在所研究的3個相關(guān)因素中。方程的B、BC表現(xiàn)為顯著，A、C、AC、A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，說明這3個因素對葡萄籽蛋白水解度影響都較大。根據(jù)F值大小，可知影響因素的主次順序為酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度。方差分析結(jié)果顯示該回歸模型適用，可適用于葡萄籽多肽提取試驗。

2.3 響應面分析

利用軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計并生成響應曲面圖及等高線圖，見圖6～圖11。

圖6 時間-溫度等高線圖Fig.6 Time-temperature contour map

圖7 時間-溫度響應曲面圖Fig.7 Time-temperature response surface map

圖8 溫度-pH等高線圖Fig.8 Temperature-pH contour map

圖9 溫度-pH響應曲面圖Fig.9 Temperature-pH response surface map

等高線圖的形狀一般趨于橢圓形和圓形，橢圓形表示因素作用顯著，而圓形則與其相反。同樣，從響應曲面圖曲面的平緩或陡峭也可以反映出兩因素交互作用的強弱，若曲面較平緩，說明兩因素交互作用不顯著，若曲面較陡，則表示兩因素交互作用顯著[12]。

從以上時間-溫度等高線圖可以看出，等高線的形狀為橢圓形，表示時間、溫度兩個因素的交互作用顯著，從時間-溫度響應曲面圖可以看出，隨著C（酶解時間）、B（酶解溫度）的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化趨勢，最佳的酶解時間和酶解溫度都在一個范圍內(nèi)，酶解溫度越高、酶解時間越長，葡萄籽蛋白的水解度都有所下降，所以，酶解溫度和酶解時間對葡萄籽蛋白的水解度有所影響。

圖10 時間-pH等高線圖Fig.10 Time-pH contour map

圖11 時間-pH響應曲面圖Fig.11 Time-pH response surface map

從以上溫度-pH值等高線圖的形狀（橢圓）可以看出，酶解溫度和酶解pH值兩個因素的交互作用顯著，從溫度-pH值的響應曲面圖可以看出，隨著pH值和酶解溫度的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化，表現(xiàn)為曲面變陡，因此，酶解溫度與酶解pH值對葡萄籽多肽的提取有極其顯著的效果。

從以上時間-pH值等高線圖的形狀（橢圓）可以看出，酶解時間、酶解pH值兩個因素的交互作用顯著，從時間-pH響應曲面圖可以看出隨著A（酶解時間）、C（酶解pH值）的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化，表現(xiàn)為曲面變得較陡，因此，酶解溫度與酶解pH值對提取效果的影響較顯著。

2.4 最佳工藝的確定及驗證試驗

對二次多項回歸方程求偏導得最優(yōu)工藝組合為酶添加量為2%、酶解溫度50.47℃，酶解時間3.61 h，酶解pH7.39，預測響應值為24.47%。為檢驗響應面法（response surface method，RSM）法的可靠性，采用最優(yōu)工藝組合進行試驗證明，基于試驗操作的可行性，選取酶添加量為2%、酶解溫度50℃、酶解pH7.4、酶解時間3 h，得到的響應值為24.33%，是理論值的95.34%，十分接近預測響應值，符合要求[19-20]。

2.5 葡萄籽蛋白酶解產(chǎn)物抑制油脂氧化活性的結(jié)果分析

不同濃度葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油過氧化值的影響見圖12。

圖12 不同濃度葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油過氧化值的影響Fig.12 Effect of different concentrations of grape seed protein hydrolysate on peroxide value of sunflower oil

由圖12明顯看出，葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油氧化的抑制作用隨著濃度增大而增強，第8天添加0.15%葡萄籽提取物的葵花籽油過氧化值明顯增高，綜合考慮，遵循經(jīng)濟原則，葡萄籽提取物用量為0.15%時抗氧化效果較好。

不同抗氧化劑對葵花籽油過氧化值的影響見圖13。

圖13 不同抗氧化劑對葵花籽油過氧化值的影響Fig.13 Effect of different antioxidants on peroxide value of sunflower oil

由圖13可知，葡萄籽蛋白酶解物和所選抗氧化劑對葵花籽油的氧化均有抑制作用，在抗氧化劑濃度都為0.15%時，葡萄籽蛋白酶解物與VC、VE相比對葵花籽油過氧化值的影響較大，抗氧化效果更好。

2.6 葡萄籽酶解物清除自由基的能力

質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系見圖14。

圖14 質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.14 The relationship between DPPH free radical scavenging rate and mass concentration

由圖14可知，葡萄籽蛋白復合蛋白酶酶解物對清除DPPH 自由基有一定的作用，在120 μg/mL～600 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除DPPH自由基的能力為19.25%～41.03%，并且葡萄籽蛋白復合酶酶解物對清除自由基的能力隨著其濃度的增加而增強。

3 結(jié)論

以曬干的葡萄籽為原料，用復合酶解法提高了葡萄籽多肽的提取得率，與VC、VE相比，葡萄籽多肽用量為0.15%時抗氧化效果較好，對自由基也有一定的清除作用，因此可以將其作為抗氧化劑在食品生產(chǎn)中得到廣泛應用。