赤霞珠葡萄皮渣酚類物質(zhì)提取及抗氧化性研究

毛建利，李艷，2，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

我國(guó)2017年葡萄酒產(chǎn)量100.1萬(wàn)噸，釀酒葡萄重量的70%可轉(zhuǎn)化為葡萄酒，其余為廢棄物，葡萄梗約5%～8%；葡萄皮和葡萄籽分別占果實(shí)部分的5%～7%和10%～15%[1-2]，由此可見，葡萄酒生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，如處理不當(dāng)，會(huì)造成環(huán)境污染[3]。廢棄物葡萄籽、葡萄皮和葡萄梗中含有大量有益物質(zhì)，梁傳紅，鄭亞蕾等[4-5]通過(guò)對(duì)葡萄籽成分及功能研究，證明其含有大量多酚類和脂肪酸類物質(zhì)，包括兒茶酸等酚酸類，黃烷酮類、花色苷類[6]、黃酮醇類等物質(zhì)及亞油酸等不飽和脂肪酸。多酚類物質(zhì)有良好的體外抗氧化能力。陶姝穎等[7]的研究顯示葡萄皮渣中富含膳食纖維、多酚類和天然色素等植物營(yíng)養(yǎng)成分，是優(yōu)質(zhì)的抗氧化膳食纖維資源。經(jīng)葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄皮渣中同樣存在著多種有益成分[8]，蘊(yùn)含著巨大的經(jīng)濟(jì)效益，其中含有花色苷[9]、白藜蘆醇、齊墩果酸等多種功能性成分，具有良好的體外抗氧化性能[10]。本研究針對(duì)我國(guó)大面積種植的釀酒葡萄赤霞珠，釀造干紅葡萄酒后的廢棄皮渣提取酚類物質(zhì)，并研究提取液的抗氧化性，目的是提高產(chǎn)業(yè)的綜合加工能力和原料利用率，改善環(huán)境，實(shí)現(xiàn)變廢為寶，為民造福。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

2015年和2016年份，昌黎產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄，采用傳統(tǒng)工藝釀造葡萄酒后收集皮渣，經(jīng)55℃低溫烘干，分離葡萄皮和葡萄籽，分別磨粉，過(guò)40目篩，備用。

過(guò)硫酸鉀、抗壞血酸、冰乙酸、無(wú)水碳酸鈉、乙酸鈉（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；DPPH、ABTS標(biāo)品（均為分析純）：上海寶曼生物科技有限公司；鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鋰（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氫鈉分析純：天津市百世化工有限公司；95%乙醇分析純：石家莊市新宇三陽(yáng)實(shí)業(yè)有限公司；三氯乙酸、沒食子酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鐵、水楊酸（均為分析純）：天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市四通化工廠；30%過(guò)氧化氫：天津政成化學(xué)制品有限公司；濃鹽酸：昆山金城試劑有限公司；氯化鉀（分析純）：天津市晶科化工有限公司；乙酸（分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；無(wú)酸鈉（分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；鉬酸鈉（分析純）：天津市化學(xué)試劑西廠；濃硫酸：珠海市華成達(dá)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；AR1140分析天平：深圳市時(shí)代之峰科技有限公司；DELTA 320pH數(shù)字酸度計(jì)：梅普勒-托利多儀器有限公司；JJ1000電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；SHZ-HI真空泵：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；電子萬(wàn)用爐、101-0AB電熱鼓風(fēng)干燥箱、SX-2.5-10馬弗爐：天津市泰斯特儀器有限公司；SP-756紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚類物質(zhì)成分測(cè)定

花色苷：pH值示差法[11]。稱取1.50g樣品溶于20mL 0.5%HCl酸化的60%乙醇溶液，50℃水浴3 h，離心去上清液。再加入15 mL酸化乙醇，50℃水浴3 h離心去上清液，重復(fù)3次，合并3次上清液定容至50 mL測(cè)定花色苷含量，求出1.50 g樣品中花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為樣品中花色苷的提取得率。

單寧（以單寧酸計(jì)）：福林-丹尼斯法[12]。稱取10.00 g樣品，于250 mL容量瓶中，加水50 mL放入60℃烘箱中過(guò)夜。次日將清液濾至250 mL容量瓶中，殘?jiān)尤?0 mL熱水，80℃水浴20 min。清液濾入容量瓶，再加30 mL熱水，80℃水浴20 min重復(fù)3到4次直至提取液與10 g/L FeCl3溶液不生成藍(lán)色產(chǎn)物為止。稀釋至刻度，離心測(cè)定樣品提取液對(duì)應(yīng)的單寧吸光度，計(jì)算單寧含量，求出10.00 g樣品中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為樣品中單寧的提取得率。

總酚（以沒食子酸計(jì)）：福林-肖卡法[13]。稱取1 g樣品，按料液比 1∶10（g/mL）加入 50%乙醇溶解，60 ℃，水浴1 h，冷卻過(guò)濾后取3 mL定容至25 mL，測(cè)定樣品提取液對(duì)應(yīng)的總酚的吸光度，計(jì)算總酚含量，求出1.00 g樣品中總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為樣品中總酚的提取得率。

1.3.2 葡萄皮和葡萄籽中酚類物質(zhì)提取

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

分別以提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比為變化因素，以總酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。溫度（℃）設(shè)定為：30、40、50、60、70，固定條件為料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇提取 60 min；提取時(shí)間（min）設(shè)定為：20、40、60、80、100，固定料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇、提取溫度60℃；乙醇濃度設(shè)定為：30%、40%、50%、60%、70%，固定料液比 1∶10（g/mL）、溫度60 ℃提取 60 min；料液比（g/mL）變量值為：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定 50%乙醇，60 ℃提取 60 min。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酚類物質(zhì)提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化酚類物質(zhì)提取的條件，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factor level table

1.3.3 葡萄皮渣中酚類提取物的體外抗氧化性能測(cè)定

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

樣品ABTS+自由基的清除能力采用分光光度法[14]：

式中：A0為不加樣品時(shí)的吸光度；A為加入不同量樣品時(shí)的吸光度。

取1 mL提取液，用提取溶劑稀釋成VC同等濃度。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為 80、90、100、110、120、140、160 的溶液。

取4 mL ABTS工作液，加入100 μL待測(cè)液，充分混勻，黑暗環(huán)境下反應(yīng)6 min后于734nm測(cè)定吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH的測(cè)定方法采用分光光度法[15]：

式中：A空白為不加樣品時(shí)的吸光度；A樣品為加入不同量樣品時(shí)的吸光度。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：10、20、30、40、50、60、70 的溶液。

分別吸取2mL樣品和VC溶液于試管中，加入2mL DPPH溶液，使總體積為4 mL，每個(gè)樣品做3個(gè)平行對(duì)照，搖勻后避光，室溫放置30 min，517 nm測(cè)定吸光值，記為A樣品。用2 mL提取溶劑代替樣品溶液，吸光值記為A空白。

1.3.3.3 羥自由基清除能力的測(cè)定羥自由基清除能力的測(cè)定采用分光光度法[16]：

式中：A1為加入樣品和羥基母體溶液時(shí)的吸光度；A2為不加羥基母體溶液時(shí)的吸光度；A0為只加羥基母體溶液時(shí)的吸光度。

取1 mL提取液，用去離子水稀釋成VC同等濃度作為待測(cè)液。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：50、100、150、200、250、300 的溶液。

取3 mL羥基母體溶液，分別加入1 mL不同濃度的待測(cè)液，充分混勻，37℃恒溫水浴15 min，530 nm測(cè)定各組的吸光值A(chǔ)1（分光光度計(jì)用去離子水校零），將羥基母體溶液用等同的提取溶劑代替，其他操作相同記為A2，將樣品溶液用等同的提取溶劑代替其它操作相同記為A0。

1.3.3.4 鐵離子還原力測(cè)定

鐵離子還原能力的測(cè)定采用分光光度法[17]：

式中：A0我加入樣品和試劑時(shí)的吸光度；A1為不加樣品時(shí)的吸光度。取1 mL提取液，用提取溶劑稀釋成VC同等濃度。VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：10、20、30、40、50、60、80、120、140 的溶液。

吸取2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL鐵氰化鉀溶液、及不同濃度的2.5 mL樣品溶液，充分混勻。50℃水浴20 min后快速冷卻，加2.5 mL10%三氯乙酸混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL 0.1%FeCl3溶液，反應(yīng)10 min，在700 nm測(cè)定吸光值（A0），將樣品用同等體積的提取溶劑替代，其他方法相同，測(cè)定吸光度A1。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本研究通過(guò) Excel 2003，Origin8.5，SPSS17.0 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的匯總與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄皮與葡萄籽中酚類物質(zhì)提取和測(cè)定結(jié)果

赤霞珠葡萄酒廢棄皮渣經(jīng)預(yù)處理得到的粉狀物，在相同提取條件下，料液比1∶10（g/mL）、50%乙醇、60℃、水浴提取60 min，以酚類物質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 樣品的酚類物質(zhì)的提取結(jié)果Fig.1 Results of phenolic extraction of samples

圖1可見，葡萄籽中總酚和單寧提取率均高于葡萄皮，分別達(dá)到6.82%和0.79%。說(shuō)明赤霞珠葡萄籽具有潛在提取酚類物質(zhì)的價(jià)值，作為后續(xù)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取酚類物質(zhì)，及抗氧化性能測(cè)定選定的樣品。由圖1還可看到葡萄皮和葡萄籽中花色苷類物質(zhì)提取率較低，分別為0.10%和0.099%，也有一定的提取價(jià)值[18]。說(shuō)明釀酒過(guò)程中對(duì)花色苷浸提效果明顯，絕大多數(shù)花色苷類物質(zhì)進(jìn)入葡萄酒中，釀酒工藝條件合適。

2.2 葡萄籽中酚類物質(zhì)提取單因素實(shí)驗(yàn)

分別進(jìn)行提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比對(duì)酚類物質(zhì)提取率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 赤霞珠葡萄籽中總酚提取條件的單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment of total phenol extraction conditions from Cabernet Sauvignon grape seed

由圖2可知，分別在提取溫度60℃，提取時(shí)間60 min，乙醇濃度 60%，料液比 1∶10（g/mL）時(shí)，酚類物質(zhì)提取率達(dá)到最高值，并出現(xiàn)拐點(diǎn)。眾所周知，在浸取過(guò)程中，溫度影響分子運(yùn)動(dòng)的速率，隨著溫度升高，固體中可溶性物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加劇，酚類物質(zhì)滲出、溶解和擴(kuò)散至溶液中[19]，60℃時(shí)總酚提取率最高為6.88%，到70℃時(shí)降低，溫度過(guò)高會(huì)破壞酚類物質(zhì)[20]或加速酚類物質(zhì)的氧化分解。在恒定溫度下，提取時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)促使物質(zhì)溶出，因此呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，達(dá)到高峰值后下降[21]，提取60 min時(shí)，總酚提取率最高達(dá)8.96%，時(shí)間再長(zhǎng)導(dǎo)致提取液中總酚成分在較高溫度下被破壞。乙醇可以改變物質(zhì)的溶解性，酸化乙醇更利于酚類物質(zhì)和單寧的溶出，葡萄籽中酚類物質(zhì)有些是醇溶性的，因此隨著乙醇濃度的提高，酚類物質(zhì)提取總量也會(huì)提高，在乙醇濃度達(dá)60%，總酚提取率最高達(dá)8.99%。料液比是指溶液的固液比例，液體量增加溶液變稀，固體物質(zhì)的傳質(zhì)阻力變小，傳質(zhì)推動(dòng)力提高，但整體提取率下降，從工程學(xué)角度說(shuō)不合算。減少溶劑用量可降低能耗、提高提取效率。從圖2看，在料液比1∶10（g/mL）附近，總酚提取率最高，達(dá)8.51%。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化赤霞珠葡萄籽中酚類物質(zhì)提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化赤霞珠葡萄籽中酚類物質(zhì)提取條件，結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化葡萄籽中酚類物質(zhì)提取條件Table 2 Orthogonal experiments to optimize the extraction conditions of phenols from grape seeds

由表3可知，各因素的極差大小順序?yàn)镃＞A＞B＞D，由此可得出，影響赤霞珠葡萄籽中酚類物質(zhì)提取率的4個(gè)因素先后順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度，最優(yōu)的提取工藝條件為：A2、B3、C3、D2，即提取溫度70℃，乙醇濃度為60%，料液比為1 ∶15（g/mL），提取時(shí)間 60 min。由表 3 可知，提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度，對(duì)總酚提取率的影響極顯著。為了考察最優(yōu)條件的再現(xiàn)性，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。在正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下，進(jìn)行驗(yàn)證和擬合試驗(yàn)，試驗(yàn)平行3次求得平均值，總酚的平均提取率10.21%。比正交表中最佳提取率提高0.88%。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Orthogonal test variance analysis results

2.4 酚類物質(zhì)提取物體外抗氧化性研究

2.4.1 酚類提取物對(duì)ABTS+自由基的清除性能

以VC為陽(yáng)性對(duì)照，研究赤霞珠葡萄籽酚類提取液對(duì)ABTS+自由基的清除率，以VC和提取液濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)比效果見圖3。ABTS/ABTS+的氧化還原電位為0.68 V，容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，生成穩(wěn)定的綠色自由基ABTS+[23]。ABTS溶液在過(guò)硫酸鉀的催化下發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，生成穩(wěn)定呈現(xiàn)綠色的ABTS+自由基。赤霞珠葡萄籽提取物具有還原性，將ABTS+自由基還原并發(fā)生褪色反應(yīng)，褪色的程度與ABTS+自由基得到的電子數(shù)目呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，因此通過(guò)溶液吸光值的改變就可了解其抗氧化性強(qiáng)弱。

圖3 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對(duì)ABTS+自由基的清除性能Fig.3 The scavenging performance of ABTS+free radicals by phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

由圖3可見，赤霞珠葡萄籽總酚提取液比VC清除ABTS+自由基的能力強(qiáng)，且隨著總酚提取液濃度增加，清除率提高，當(dāng)赤霞珠葡萄籽總酚提取液加入量到100 μg/mL以上時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率能達(dá)到100%，由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，赤霞珠葡萄籽總酚提取物對(duì)ABTS+自由基的清除效果明顯。

2.4.2 酚類物質(zhì)提取物對(duì)DPPH自由基的清除性能

DPPH自由基有單電子，在517 nm有強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，因與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析，抗壞血酸等具有遞電子和遞質(zhì)子能力的抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除作用是通過(guò)抗氧化劑把電子和質(zhì)子傳遞給DPPH自由基，從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)DPPH2的結(jié)果[25]。以VC和提取液濃度為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)比效果見圖4。

圖4 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對(duì)DPPH自由基的清除性能Fig.4 DPPH free radical scavenging performance of phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

赤霞珠籽總酚提取液的加入量在20 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到95.00%，隨提取液量濃度增加，清除率增加，當(dāng)提取液的加入量達(dá)到30 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到100%。VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除力明顯低于葡萄籽總酚提取液對(duì)DPPH的清除能力。

2.4.3 酚類物質(zhì)提取物對(duì)羥自由基的清除性能

羥自由基（·OH）系活性氧的一種，它可以通過(guò)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，參與奪氫及羥基化等反應(yīng)與生物體內(nèi)多種分子作用，引起機(jī)體損傷，酚類物質(zhì)和VC可作為還原劑或自由基清除劑能提供一個(gè)氫原子與羥自由基結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[26]，從而改變整個(gè)反應(yīng)體系的吸光度，由此計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除性能。以VC和提取液濃度為橫坐標(biāo)，羥自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)比效果見圖5。

圖5 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對(duì)羥自由基的清除性能Fig.5 The scavenging properties of hydroxyl free radicals of phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

由圖5可知，提取液對(duì)羥自由基的清除能力略高于VC。如VC濃度0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為54.44%，而同等濃度的赤霞珠籽總酚提取液對(duì)羥自由基的清除率為65.12%。隨濃度增加對(duì)羥自由基的清除率都明顯上升。

2.4.4 赤霞珠葡萄籽中酚類物質(zhì)提取物對(duì)鐵還原力的測(cè)定

還原力法的原理為：K3Fe（CN）6+樣品→K4Fe（CN）6+樣品氧化物 K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

在700 nm測(cè)定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。以VC和提取液濃度為橫坐標(biāo)，鐵離子的清除率為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)比效果見圖6。

圖6 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對(duì)鐵還原力的測(cè)定Fig.6 Determination of iron reducing power of phenolic extracts from Cabernet Sauvignon grape seed

鐵還原力的測(cè)定試驗(yàn)中，赤霞珠籽總酚提取液加入量在20 μg/mL時(shí)對(duì)鐵離子的清除率達(dá)到77.5%，隨提取液濃度增加，清除率升高。相同濃度的VC溶液對(duì)鐵離子的清除率能達(dá)到71.82%。由此可知，赤霞珠籽總酚提取液對(duì)鐵離子的還原力大于VC。

3 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，影響赤霞珠葡萄籽中酚類物質(zhì)提取率的4個(gè)因素先后順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度，最優(yōu)的提取工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度為 60%，料液比為 1∶15（g/mL），提取時(shí)間60 min。在最優(yōu)提取條件下得到的總酚的提取率為10.21%。

以VC為參照測(cè)定提取液對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基、羥自由基清除力和鐵離子還原力。結(jié)果顯示提取液對(duì)自由基清除能力及鐵離子的還原能力均高于VC溶液，對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，濃度為20 μg/mL的提取液對(duì)DPPH自由的清除率可達(dá)95%。說(shuō)明酚類提取液體外抗氧化能力較強(qiáng)。

赤霞珠葡萄釀酒后廢棄的皮渣含有豐富的可利用資源，具有提取酚類物質(zhì)，并開發(fā)抗氧化保健產(chǎn)品的潛在效益。