香水檸檬果皮綠色素提取工藝及其穩定性研究

郗艷麗，周旋，霍明洋，翟曉瑞，馬鵬，馬一芯，張栩銘，徐斌

（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

香水檸檬[Citrus Limon（L.Burm.F.）]為臺灣培育品種，屬于須根系植物，性喜溫暖、耐陰、耐寒、不怕熱，其果型修長，果大色美，長圓型，該果香氣濃郁且維持較持久，完全沒有其他檸檬的酸澀味道，因其汁水香氣濃郁，故有“香水檸檬”之稱，因其無籽也叫“無籽檸檬”。香水檸檬一年四季花果同期，所以也稱“臺灣四季香水檸檬”。其最大特點是高產早產、果形美觀、汁多味香。成熟時果皮黃綠至淡黃色，形狀美觀，果皮光滑，味道清甜，肉嫩汁多，氣味香郁，無苦澀味，可以直接榨成果汁。香水檸檬能生津止渴，清熱解暑，行氣消食，化痰止咳，具有美容護膚、調味、補充鐵鈣、殺菌等功效，更是養顏美容、瘦身之佳品[1]。香水檸檬是世界上最有藥用價值的水果之一，它富含維生素B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 C、P、檸檬酸、煙酸、蘋果酸、高量鉀元素和低量鈉元素等，具有防止腎結石形成、防治心血管疾病、防治動脈血管硬化和血栓的形成、止血、抗癌、治療腹瀉、預防流感等作用[2-3]。香水檸檬果汁具有較好的抗氧化作用[4]，其對預防老年性疾病有較好的作用。香水檸檬果皮富含色素、果膠和檸檬精油等成分，與檸檬果皮一樣，可成為生產香精香料及食品工業、輕紡工業、醫藥業的重要原材料[5-10]。為有效利用資源，變廢為寶，本研究擬采用響應曲面法優化香水檸檬果皮綠色素的提取工藝，為香水檸檬的開發應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香水檸檬：產地海南，吉林市市售；無水乙醇（分析純）：北京化工廠；維生素C（Vitamin C，VC）、TiO2（分析純）：上海生工生物工程有限公司；檸檬酸、NaOH（分析純）：西隴化工股份有限公司；山梨酸鉀（食品級）、可溶性淀粉（食品級）、氯化鈉、葡萄糖、β-環胡精、聚乙二醇、AgNO3：國藥集團化學試劑有限公司；MgSO4、KCl（分析純）：麥克林公司；Al（NO3）3（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；FeSO4（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；FeCl3（分析純）：阿拉丁有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-S26數顯恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；MS-H-Pro磁力加熱攪拌器：大龍興創實驗儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計：日本島津公司；QUINITIX124-1CN電子精密分析天平：德國賽多利斯有限公司；KQ-800KDE高功率超聲波清洗儀：昆山舒美超聲儀器有限公司；ZN多功能粉碎機：中南制藥機械廠；202-1型電熱恒溫鼓風干燥箱：天津泰森儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香水檸檬果皮綠色素的前處理及提取工藝

參考文獻[11]，將新鮮的香水檸檬洗凈后剝皮，將皮切成碎片后經60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩后備用。稱取一定量的香水檸檬果皮樣品，加入一定量的提取劑超聲輔助提取，3 000 r/min離心10 min，取上清液過濾后即為香水檸檬果皮綠色素提取液。

1.3.2 香水檸檬果皮綠色素最佳吸收波長的確定

精確稱取0.5 g香水檸檬果皮粉末，加入體積分數為70%的乙醇溶液25 mL，在480 W功率下進行超聲波輔助提取45 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液定容至25 mL，以提取溶劑作為空白對照，在300 nm～800 nm波長處測定綠色素的吸光度，確定香水檸檬果皮綠色素的最佳吸收波長。

1.3.3 單因素試驗

以香水檸檬果皮綠色素吸光度值為指標，在固定提取條件下考察提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響。提取時間分別為 15、30、45、60、75、90 min，提取功率分別為320、400、480、560、640W，乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%，液料比分比為15∶1、30 ∶1、45 ∶1、60 ∶1、75 ∶1、90 ∶1（mL/g）。其中固定提取條件為：提取時間45 min、提取功率480 W、乙醇體積分數70%以及液料比45∶1（mL/g），每克香水檸檬果皮的提取液定容至100 mL后檢測吸光度值。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比4個因素，采用Box-Behenken試驗設計，進行四因素三水平試驗，試驗因素水平表如表1所示。

表1 試驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3.5 香水檸檬果皮綠色素穩定性研究

按優化的工藝提取香水檸檬果皮綠色素，每克香水檸檬果皮綠色素提取液定容至60 mL。按照下列步驟檢測不同條件對綠色素穩定性的影響。

1.3.5.1 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL分別在 4、20、40、60、80、100 ℃條件下處理 0、30、60、90、120、150、180 min，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值。

1.3.5.2 光照對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別置于避光、室內自然光和日光直射處放置0、2、4、6、8、10、12、14 d，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值。

1.3.5.3 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別加入0.05 mol/L山梨酸、可溶性淀粉、檸檬酸、葡萄糖、β-環胡精、VC、氯化鈉和聚乙二醇溶液各5 mL，經漩渦混勻器搖勻后，室溫處理60 min，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值，以等體積含有食品添加劑的溶液在0 min時測定的吸光度為對照。

1.3.5.4 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別加入 0.05 mol/L Mg2+、K+、Ti4+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ag+和Na+溶液各5 mL，經漩渦混勻器搖勻后，室溫處理10 h，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值，以等體積含有金屬離子的溶液在0min時測定的吸光度為對照。

2 結果與分析

2.1 香水檸檬果皮綠色素最大吸收波長的選擇

香水檸檬果皮綠色素吸收光譜見圖1。

圖1 香水檸檬果皮綠色素吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

從圖1可知，香水檸檬果皮綠色素在415 nm和666 nm處均有明顯吸收峰，其中在415 nm處峰值最高，故選415 nm為測定香水檸檬果皮綠色素吸光度值的檢測波長。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

提取時間對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖2。

圖2 提取時間對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖2可知，隨著提取時間的延長，綠色素溶液吸光度值不斷增大，只是因為超聲處理的時間延長、細胞破碎的程度增大后，細胞內部的綠色素物質開始向外擴散，使溶劑中的綠色素含量迅速上升。當提取時間為60 min時，色素溶液吸光度值達到最大值。當提取時間繼續延長時，綠色素溶液吸光度值反而下降，這表明60 min時香水檸檬果皮綠色素已提取完全，而隨著綠色素在空氣中暴露的時間延長，導致部分綠色素降解氧化，造成綠色素含量下降。而且提取時間過長，乙醇容易揮發，溶劑與原料的接觸也不十分充分，綠色素不能完全溶出，提取率相應降低。因此選取60 min為最佳提取時間進行后續試驗。

2.2.2 提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖3。

圖3 提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction power on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖3可知，隨著提取功率的增大，綠色素吸光度值呈現先上升后下降的趨勢，并在提取功率為560 W時達到最大。當提取功率超過560 W時，綠色素吸光度值反而降低。增大超聲波功率強化傳質同時使細胞的破碎程度增加，從而有利于綠色素的提取[12-13]。但當超聲波功率過大時，會引起綠色素結構被破壞或降解。因此，選取560 W為最佳提取功率進行后續試驗。

2.2.3 乙醇體積分數對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

乙醇體積分數對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖4可知，隨著乙醇體積分數的升高，綠色素溶液吸光度值逐漸升高，但在70%之后逐漸下降。這可能與綠色素中葉綠素的親水基團有關。當乙醇體積分數達到70%時，親水基團基本與水結合并充分溶解于水中。當乙醇中的水分含量越低，綠色素分子的親水基團不易與蛋白質分離，不利于綠色素從類囊體膜中游離出來，親水基團與水結合的能力相應降低，提取效果隨之降低[14]。因此，選取70%的乙醇體積分數為最佳液料比進行后續試驗。

2.2.4 液料比對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖5。

圖5 液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖5可知，隨著液料比增加，乙醇滲透細胞膜的效果越明顯，超聲波對細胞的作用越強，利于綠色素從細胞中分離進入提取溶劑中，因而提取效果也越好，綠色素溶液吸光度值越高。當液料比為45∶1（mL/g）時，綠色素萃取的比較完全，當液料比繼續增加后，綠色素提取效果逐漸降低，吸光度值逐漸下降。而且，液料比太大，增加了濃縮操作的困難，浪費能源[15]。綜合考慮，為節約生產成本，選取 45∶1（mL/g）為最佳液料比進行后續試驗。

2.3 香水檸檬果皮綠色素提取條件的優化

由圖2～圖5可知，在不同提取時間、提取功率、乙醇體積分數、液料比下，香水檸檬果皮綠色素的提取效果均存在差異，故而在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhken的中心組合試驗設計原理，選取提取時間A、提取功率B、乙醇體積分數C、液料比D作為4個因素，并以綠色素提取液吸光度作為響應值，試驗方案及結果見表2。

對數據進行回歸分析，獲得回歸方程：Y=0.44+0.01A+0.03B+0.019C+0.017D+0.008 5AB+0.02AC-0.000 25AD+0.007 5BC-0.028BD-0.11CD-0.014A2-0.029B2-0.017C2-0.012D2。為驗證方程的有效性，對上述結果進行數據分析，方差分析結果見表3。響應值的可信度分析的模型相關系數R2=0.908 6，接近于1，表示模型相關度很好。校正系數R2Adj=0.817 2，該模型能解釋81.72%響應值的變化，因而該模型擬合程度比較好。變異系數C.V.=3.75%，說明該數學模型的置信度較好，可以用此模型對超聲提取香水檸檬果皮綠色素進行分析和預測。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

續表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，該模型的F值為9.940 921，P值＜0.000 1，判斷該模型是極顯著的；響應值的模型失擬項P=0.352 5，說明模型失擬項不顯著。綜上所述，該模型對綠色素溶液吸光度值的擬合程度好，試驗誤差小。該試驗中4個單因素對綠色素提取效果的影響排序為提取功率＞乙醇體積分數＞液料比＞提取時間。模型方程回歸系數和顯著性檢驗結果表明，模型一次項B、C、D 極顯著，A 顯著；二次項 B2極顯著，A2、C2顯著，D2不顯著；交互項BD極顯著，AC顯著，AB、AD、BC、CD不顯著。因此各個具體試驗因素與響應值都不是線性關系。

提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比的交互作用對香水檸檬果皮綠色素提取的影響響應面圖見圖6。

圖6 提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比的交互作用對香水檸檬果皮綠色素提取的影響響應面圖Fig.6 The response surface figure of effects of extraction time，extraction power，ethanol concentration，and liquid-solid ratio on the extraction of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

圖6a表示提取功率和提取時間對綠色素提取的影響，隨著提取功率和提取時間的上升，綠色素吸光度呈先增加后下降的趨勢，但交互作用不大。圖6b表示乙醇體積分數和提取時間交互作用對綠色素提取的影響，隨著乙醇體積分數和提取時間的增加，綠色素吸光度呈先增加后降低的趨勢，兩者交互作用顯著。隨著乙醇體積分數的增加，綠色素吸光度值上升，但乙醇體積分數達到一定比例后，綠色素吸光度值變化不大。這可能與綠色素本身特性有關。乙醇體積分數過高，可能使極性較大的物質無法溶出，因而綠色素的吸光度值下降。延長提取時間，在一定范圍內可以得到較高的綠色素吸光度值。圖6c表示液料比和提取時間交互作用對綠色素提取的影響，隨著液料比和提取時間的增加，綠色素吸光度值變化不大，呈現先增加后降低的趨勢，但其交互作用不顯著。圖6d表示乙醇體積分數和提取功率交互作用對綠色素提取的影響，隨著乙醇體積分數和提取功率的增加，綠色素吸光度值先增加后降低，但其交互作用不顯著。乙醇體積分數對綠色素提取的影響高于提取功率對綠色素提取的影響。圖6e表示液料比和提取功率交互作用對綠色素提取的影響，隨著液料比和提取功率的增加，綠色素吸光度值先升高后降低，且交互作用非常顯著。增加液料比和提取功率，在一定范圍內可得到較高的綠色素吸光度值。圖6f表示液料比和乙醇體積分數交互作用對綠色素的影響，隨著液料比和乙醇體積分數的增加，綠色素吸光度值先逐漸升高后逐漸降低，但交互作用不顯著。

以提取時間、提取功率、乙醇體積分數和液料比為考察因素，以吸光度值為響應值，經Desigh Expert 8.0.6軟件分析可得最佳工藝條件為提取時間75 min，提取功率639.53 W，乙醇體積分數80%，液料比31.17∶1（mL/g），相應的響應面二次模型預測綠色素吸光度最大值為0.466。為了試驗操作方便，本研究選取提取功率640 W和液料比31∶1（mL/g）為試驗條件進行驗證試驗。在最佳條件下重復3次試驗，得到果皮中綠色素的吸光度均值為0.459，與回歸方程預測的數值相似，說明香水檸檬果皮綠色素的提取工藝準確可行，在此條件下提取綠色素進行以下試驗。

2.4 香水檸檬果皮綠色素穩定性結果分析

2.4.1 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

溫度對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響見表4。

表4 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響Table 4 Effect of temperature on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表4可知，4℃～60℃范圍內處理0 min～180 min，提取的綠色素吸光度值逐漸降低，顏色由黃綠色變為淡黃色，綠色素提取后處理的時間越長，降解失活的越多，因此顏色逐漸變淡。而100℃處理后，隨著處理時間的延長，綠色素吸光度值逐漸升高，這可能與高溫狀態下，溶劑不斷蒸發，而綠色素出現濃縮有關。結果表明，提取的綠色素可在常溫條件下保存。

2.4.2 光照對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

光照對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響見表5。

表5 光照對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響Table 5 Effect of light on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表5可知，隨著室內自然光和日光照射時間的延長，綠色素的吸光度值逐漸降低，顏色由黃綠色逐漸變成淡黃色。照射處理2天時，日光照射后綠色素的吸光度值顯著低于室內自然光照射后綠色素的吸光度值。光照處理14天后，避光處理的綠色素吸光度值略有降低，但降低的不十分明顯，而室內自然光照射和日光照射處理的綠色素吸光度值降低顯著。結果表明綠色素在避光條件下保存，可避免降解，而在接觸日光的條件下，綠色素容易降解，不利于保存。

2.4.3 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響見表6。

表6 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響Table 6 Effect of food additives on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表6可知，提取的綠色素中加入不同的食品添加劑處理后，綠色素的吸光度值幾乎無變化，顏色也為黃綠色。說明食品添加劑對提取的綠色素影響不大。

2.4.4 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響

金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響見表7。

表7 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩定性的影響Table 7 Effect of metal ions on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表7可知，Mg2+和Ag+使綠色素由黃綠色變成淡黃色，Al3+使提取的綠色素由黃綠色變為淡黃色沉淀，吸光度值變化較大。Fe2+和Fe3+使綠色素由黃綠色變為深黃色。K+、Ti4+和Na+對綠色素的穩定性無影響。

3 結論

研究超聲輔助提取香水檸檬果皮中綠色素的工藝，結果表明以乙醇為提取溶劑，提取時間75 min，提取功率 640 W，乙醇體積分數 80%，液料比 31∶1（mL/g）條件下，提取的綠色素含量最高，效果最佳。在此條件下，提取的綠色素吸光度均值為0.459。穩定性試驗表明，保存溫度對綠色素由一定的影響，溫度越高，綠色素的穩定性越差。光照條件下會降低綠色素的穩定性，避光條件有利于綠色素的保存。Al3+、Fe2+和Fe3+對綠色素的穩定性影響較大。