云南省主要小雜糧多酚對亞硝酸鹽的清除作用

陳春華，楊士花，初雅潔，李淳，畢曉菲，李晴，羅恒國，李永強，*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201；2.云南農業大學外語學院，云南昆明650201；3.大理農林職業技術學院，云南大理671003；4.云南永平縣綜合檢驗檢測院，云南永平672600；5.云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南保山678000）

小雜糧作為云南種植業結構優化的特色作物[1]，有著種植面積廣、產量高和品種資源豐富等優勢，種植面積占全國的6.1%，產量占全國的7%～11.7%[2]，在糧食產業開發中具有較大的潛力。云南省主要的小雜糧包括紅米、黑米、苦蕎、老黑谷米、藜麥、青稞、甜蕎、薏仁、燕麥、紫米等[3-4]。小雜糧中不但含有蛋白質等營養物質，而且富含多酚等功能性物質。研究發現，谷物中酚類化合物約90%為酚酸，阿魏酸含量占酚酸的90%以上[5-7]。小雜糧中多酚含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素[8]，具有抗氧化、抗菌、抗衰老等作用，能夠預防癌癥、預防心血管疾病[9-11]。

亞硝酸鹽具有發色、抑菌、防腐、增加風味等作用[12-13]，是食品工業中一種非常重要的添加劑。但是研究表明，亞硝酸鹽可以與二甲胺結合，生成有致癌作用的二甲基亞硝胺，對人類健康具有潛在威脅[14-15]。多酚具有一定的還原性，亞硝酸鹽具有一定的氧化性，兩者發生氧化還原反應[16]，能夠阻斷亞硝胺合成，進而清除亞硝酸鹽。研究發現果蔬、香辛料和茶葉的多酚對亞硝酸鹽有一定的清除作用[17-19]。目前，關于小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用研究鮮有報道。本試驗在單因素試驗的基礎上利用響應面優化確定青稞多酚清除亞硝酸鹽的最佳工藝條件，基于小雜糧中阿魏酸是主要的多酚化合物，所以在此條件下，比較研究10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽的清除作用，為小雜糧的開發利用提供科學理論依據，也為小雜糧的精深加工提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫米：墨江縣農業局；青稞：迪慶藏族自治州農科所；老黑谷米：云南迪慶州維西縣攀天閣鄉；藜麥、薏仁、燕麥、紅米、黑米、甜蕎、苦蕎：云南省中儲糧儲備庫。

鹽酸萘乙二胺：國藥集團化學試劑有限公司；對氨基苯磺酸：天津市光復精細化工研究所；亞硝酸鈉：西隴化工股份有限公司；阿魏酸：北京北納創聯生物技術研究院；Folin-Ciocalteau試劑：sigma公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；冷凍干燥機：鄭州南北儀器設備有限公司；UV-1800CP紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；磨粉機：廣州雷邁機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚的提取

參考文獻[20]略做改動，小雜糧磨粉后，過50目篩，制得面粉樣品，準確稱取小雜糧面粉20 g于500 mL的燒杯中，加入75%的乙醇400 mL，超聲提取25 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，40℃下減壓濃縮后，然后將濃縮液冷凍干燥，得到小雜糧多酚提取物。

1.3.2 多酚含量的測定

參考文獻[21-22]略做改動，稱取0.05 g的小雜糧多酚提取物于50 mL的離心管中，用乙醇定容至10 mL備用，取小雜糧多酚樣液1 mL于50 mL離心管中，加入0.5 mL的Folin-Ciocalteau，再加入1 mL的飽和Na2CO3，定容至10 mL。在避光處反應35 min后，離心10 min，以不加入小雜糧多酚提取液管為空白組，于725 nm測定吸光度，以阿魏酸為標準品建立回歸方程為：

式中：y為多酚含量，μmol；x為阿魏酸濃度，μmol/L；結果表示為每g樣品所含總多酚相當于阿魏酸的微摩爾數[μmol ferulic acid equivalents（FAE）/g]。

1.3.3 亞硝酸鹽清除率的測定

依據GB 5009.33-2016《食品安全國家標食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行亞硝酸鹽的測定。準確移取0.5 mL 200 μg/mL NaNO2置于50 mL的離心管中，加入一定量的小雜糧多酚提取液，用蒸餾水定容至10 mL后，取2 mL反應液于50 mL容量瓶中，加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸，搖勻靜置5 min，然后加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，搖勻靜置15 min，于538 nm處測定吸光度。按照下式計算清除率：

式中：A1為未加入小雜糧多酚提取液所測得的吸光度；A2為加入小雜糧多酚提取液所測得的吸光度。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響

準確吸取 0.5、1、1.5、2、2.5 mL 濃度為 25 mmol/mL的青稞多酚提取液于50 mL的離心管中，分別加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至10 mL，在60℃條件下反應30 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.4.2 反應溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響

準確吸取1 mL濃度為25 mmol/mL的青稞多酚于50 mL的離心管中，加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至 10 mL，分別在 40、50、60、70、80 ℃下反應30 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.4.3 反應時間對亞硝酸鹽清除作用的影響

準確吸取1 mL濃度為25 mmol/mL的青稞多酚于50mL的離心管中，加入0.5mL的NaNO2（200μg/mL），用蒸餾水定容至10 mL，在60℃下分別反應10、20、30、40、50 min，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，根據中心組合設計（central composite design，CCD）原理[23]，選取反應溫度（X1）、反應時間（X2）和青稞多酚濃度（X3）3 個因素，設計三因素五水平試驗，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計和結果方差分析。

1.3.6 小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用的比較研究

準確吸取1.1 mL濃度為25 mmol/mL的10種小雜糧多酚（多酚含量相同，相當于阿魏酸27.5 mmol）于50 mL的離心管中，分別加入0.5 mL的NaNO2（200 μg/mL），用蒸餾水定容至 10 mL，在最佳工藝條件下進行反應，以蒸餾水代替樣品作空白。取2 mL反應液，參照1.3.3方法計算亞硝酸鹽的清除率。

1.3.7 數據分析

所有樣品重復3次，采用SPSS 22.0軟件，通過t檢驗方法進行 ANOVA分析。采用Design-Expert 8.0.6，通過CCD原理進行響應面試驗設計。

2 結果與分析

2.1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響

青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除率的影響見圖1。

圖1 青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.1 The effect of hulless barley polyphenols at different concentrations on nitrite scavenging rate

由圖1可知，隨著青稞多酚用量的增大，青稞多酚對亞硝酸鹽清除率呈增加趨勢，但是當多酚用量超過1 mL后，清除作用增加不明顯，可能是由于青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用達到飽和所致，同時增大用量，會增加成本，所以選擇青稞多酚用量1 mL為宜。

2.2 反應溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響

反應溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響見圖2。

圖2 反應溫度對亞硝酸鹽清除作用的影響Fig.2 The effect of reaction temperature on nitrite scavenging rate

由圖2可知，隨著溫度的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率呈先上升后下降的趨勢。在60℃時清除率達到最大值為60.2%，當溫度大于60℃時，隨溫度的升高，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用呈下降趨勢，原因可能是多酚化合物對熱不穩定，溫度過高會使其氧化破壞，所以反應溫度選取60℃為宜。

2.3 反應時間對亞硝酸鹽清除作用的影響

反應時間對亞硝酸鹽清除作用的影響見圖3。

圖3 反應時間對亞硝酸鹽清除作用的影響Fig.3 The effect of reaction time on nitrite scavenging rate

由圖3可知，隨反應時間的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率呈增加趨勢。但超過30 min時，隨反應時間的增加，青稞多酚對亞硝酸鹽的清除作用增加不明顯。這是因為在30 min內，反應時間的增加，反應物分子間的碰撞機率增大，清除作用增加。在30 min后，多酚已經基本反應完畢，清除率變化不明顯，因此反應時間選取30 min為宜。

2.4 青稞多酚清除亞硝酸鹽的響應面優化

在單因素試驗結果的基礎上，以反應溫度（X1）、反應時間（X2）和青稞多酚用量（X3）3個因素為自變量，設計三因素五水平試驗。試驗設計和結果見表1和2。

利用Design Expert軟件對試驗結果進行分析，得到回歸模型如下：

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and test design levels

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and result of central composite design

根據試驗結果進行方差分析，由表3可知，該模型的 F=42.91，P＜0.000 1，說明回歸模型高度顯著，失擬項P=0.142 5＞0.05，說明失擬項不顯著，說明回歸方程與實際情況擬合良好，能夠反映亞硝酸鹽的清除作用與青稞多酚用量、反應溫度和反應時間的關系。回歸模型方差分析表見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation

2.4.1 響應曲面圖分析

根據回歸模型做響應面的三維圖，如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對亞硝酸鹽清除率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions of various factors on the nitrite scavenging rates

由圖4a可知，沿青稞多酚用量軸向等高線更為密集，說明青稞多酚用量對亞硝酸鹽清除作用的影響更加顯著，青稞多酚用量和反應溫度的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響顯著。由圖4b可知，反應溫度比反應時間顯著，曲面相對陡峭。沿反應溫度軸向等高線更為密集，表示亞硝酸鹽的清除率對反應溫度的變化敏感，反應溫度和反應時間的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響不顯著。由圖4c可知，青稞多酚用量比反應溫度更加顯著，曲面相對陡峭。沿青稞多酚用量軸向等高線密集，而反應時間軸向等高線稀疏，說明亞硝酸鹽清除率對青稞多酚用量變化比對反應溫度的變化更為敏感，青稞多酚用量和反應時間的相互作用對亞硝酸鹽清除的影響不顯著。

2.4.2 驗證試驗

利用Design-Expert得到各個因素組合最佳工藝條件為青稞多酚用量1.11 mL，在59.04℃的條件下，反應33.5 min，對亞硝酸鹽的清除率的理論值為63.72%。考慮操作的實際，修正3個數據組合為青稞多酚用量1.1 mL，反應溫度59℃，反應時間34 min，在該條件下，進行了驗證試驗，得到青稞多酚對亞硝酸鹽的清除率為64.04%（RSD=0.46%），與理論值十分接近，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，此工藝條件準確可靠。

2.5 云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率

云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率見圖5。

圖5 云南10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除率Fig.5 Nitrite scavenging rates of 10 small grains polyphenols in Yunnan province

研究發現阿魏酸為谷物中主要的多酚化合物[5-7]，所以本文采用青稞多酚清除亞硝酸鹽的工藝條件比較10種小雜糧多酚對亞硝酸鹽的清除作用。由圖5可知，在最佳工藝條件下，10種小雜糧中多酚對亞硝酸鹽清除范圍為23.90%～86.24%，黑米多酚（86.24±1.00）%和紫米多酚（83.59±1.53）%對亞硝酸鹽的清除能力顯著高于其他小雜糧多酚（p＜0.05），藜麥多酚（23.90±2.42）%對亞硝酸鹽的清除能力顯著低于其它小雜糧多酚（p＜0.05）。這可能是不同小雜糧中含有的多酚種類和組成有差異，不同多酚類化合物所含的酚羥基數量及位置不同，影響到其對亞硝酸鹽的清除作用。

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應面優化得到最佳條件為青稞多酚用量1.1 mL，反應溫度59℃，反應時間34 min，對亞硝酸鹽的清除率為64.04%。10種小雜糧中多酚對亞硝酸鹽清除范圍為23.90%～86.24%，其中黑米（86.24±1.00）%和紫米（83.59±1.53）%對亞硝酸鹽的清除作用顯著高于其他小雜糧（p＜0.05），藜麥（23.90±2.42）%對亞硝酸鹽的清除作用顯著低于其它小雜糧（p＜0.05）。小雜糧多酚對亞硝酸鹽清除作用的機理還有待進一步研究，因而后面的研究可進一步對小雜糧提取物進行分離純化，并探討它們對亞硝酸鹽清除作用的構效關系，為小雜糧的開發和綜合利用提供理論依據。