細胞因子信號轉導負調控蛋白2在變應性鼻炎中的表達及臨床意義

劉海濤 羅 慶 范 立 楊 甜

1.南昌大學第一附屬醫院耳鼻喉頭頸外科，江西南昌 330006；2.江西衛生職業學院五官教研室，江西南昌 330052

變應性鼻炎（AR）是一種以變應原激發、IgE 介導、T 輔助細胞（Th）2 反應為主的慢性鼻部疾病［1］。主要分類是Th1、Th2 細胞和調節性T 細胞（Treg）［2］。Th1細胞分泌γ 干擾素（IFN-γ）和白細胞介素（IL）-2 等細胞因子，Th2 細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13。在這些細胞因子中，Treg 細胞調節Th1/Th2 平衡起關鍵作用［3-4］。細胞因子信號轉導負調控蛋白（SOCS）2 是SOCS 家族中的重要成員［5-6］。Knosp 等［7］研究證明，SOCS2 基因敲除小鼠對Th2 介導的氣道炎癥的易感性增加。本研究初步觀察SOCS2 在AR 組織中的表達情況及與炎性因子的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源與分組

AR 組選取南昌大學第一附屬醫院2018 年2～7 月行鼻中隔偏曲或翼管神經切斷術的AR 患者20 例，男11 例，女9 例，年齡20～69 歲。對照組鼻中隔偏曲且無其他鼻科疾病的患者15 例，男8 例，女7 例，年齡18～65 歲。取下鼻甲前端鼻黏膜剪成兩份，一份置于4%多聚甲醛固定；另一份放入含有Trizol 的離心管內，轉移到冰箱中保存。

1.2 試劑與材料

SOCS2 兔抗人多克隆抗體（bs-1896R）購于北京博奧森有限公司。Trizol 購于Invitrogen 公司。通用型試劑盒（小鼠/兔聚合物法檢測系統pv-6000）、正常山羊血清（ZLI-9022）、二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒（ZLI-9017）購于北京中衫金橋有限公司。

1.3 免疫組化法檢測SOCS2 表達

標本置于4%多聚甲醛中固定24 h、常規石蠟包埋，脫蠟，修復抗原，去除內源性過氧化物酶，用正常山羊血清封閉，滴加一抗SOCS2（1∶300），4℃過夜，PBS 沖洗3 次，加辣根酶標記抗山羊IgG 室溫孵育1 h，顯色劑顯色，樹膠封片。陰性組以封閉液替代一抗。將圖像輸入Image-pro Plus 6.0 專業圖像分析軟件，計算平均吸光度值。

1.4 SOCS2 mRNA 及T 細胞因子mRNA 表達

引物合成：在GenBank 查找人類SOCS2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、FOXP3 序列，引物設計和檢測采用Primer 5.0 軟件。引物由華大基因有限公司合成。引物序列如下，SOCS2：5'-ACGCGAACCCTTCTCTGACC-3'，5'-CATTCCCGGAGGGCTCAAGG-3'；IFN-γ：5'-AGTGATGGCTGAACTGTCGC-3'，5'-CTGGGATGCTCTTCGACCTC-3'；IL-4：5'-GTGCACCGAGTTGACCGTAA-3'，5'-GCGAGTGTCCTTCTCATGGT-3'；IL-5：5'-GGATGCTTCTGCATTTGAGTTT-3'，5'-CAGTGCCAAGGTCTCTTTCA-3'；IL-13：5'-CTGCAATGGCAGCATGGTAT-3'，5'-TCAGCATCCTCTGGGTCTTC-3'；FOXP3：5'-GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC-3'，5'-ATGGCCCAGCGGATGAG-3'；GAPDH：5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCT -3'，5'-CAAATGAGCCCCA -GCCTTCT-3'。用Trizol 試劑從鼻組織中提取總RNA。用寡聚體（dT）18 引物和M-MLV 逆轉錄酶（TaKaRa Bio Inc）從2 μg 總RNA 中合成cDNA。用ABI PRISM 7600檢測系統（美國加州福斯特市生物系統）和SYBR 預混Taq（TaKaRa Bio Inc）進行實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。計算樣本復制物的循環閾值（Ct）。計算靶基因mRNA水平的倍數變化為2-ΔΔCt。qPCR 儀（StepOneTMReal-Time PCR System）進行mRNA 定量檢測，反應條件如下：95℃變性30 s；95℃，15 s；60℃，1 min 退火、延伸，共40 個循環。

1.5 AR 患者視覺模擬評分（VAS）

評價六大癥狀（噴嚏、流涕、鼻癢、鼻塞、眼癢和流淚）。方法：患者在標尺上標出各種癥狀相應分值，“0”代表無此種癥狀，“10”代表此種癥狀最重，統計VAS總分［8-9］。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 6 進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，采用t 檢驗，不符合正態分布的計量資料用中位數（四分位數間距）［M（Q）］表示，采用Mann-Whitney U 檢驗；計數資料采用χ2檢驗；確定變量線性關系采用Pearson 相關檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AR 組與對照組的SOCS2 免疫組化表達及平均吸光度值比較

SOCS2 在AR 組和對照組中均有免疫組化表達。AR 組SOCS2 平均吸光度值顯著低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖1（封四）。

2.2 AR 組與對照組SOCS2 和細胞因子的相對表達量比較

qRT-PCR 顯示，AR 組的SOCS2、IFN-γ 和FOXP3相對表達量顯著低于對照組，IL-5、IL-13、IL-4 相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

2.3 AR 患者SOCS2 與細胞因子和VAS 總分的相關性

AR 患者SOCS2 相對表達與IL-4、IL-5、IL-13、VAS 總分相對表達呈負相關（r=-0.66、-0.50、-0.51、-0.65，P ＜0.05），與FOXP3 相對表達呈正相關（r=0.67，P ＜0.05），與IFN-γ 相對表達無相關性（r=0.39，P ＞0.05）。見圖3。

圖2 AR 組與對照組SOCS2 和細胞因子的相對表達量比較

圖3 AR 患者SOCS2 與細胞因子和VAS 總分的相關性

3 討論

AR 的發病機制為環境中刺激因子作用于具有遺傳背景的個體，引起T、B 淋巴細胞免疫功能紊亂，主要表現為Th2 的優勢活化［10-13］。研究證實［14］，SOCS2 參與Th 細胞平衡調節，抑制Th2 細胞分化和發育，對Treg 穩定有重要作用［15-16］。

本研究顯示，AR 組SOCS2 免疫組化表達和平均吸光度值均較對照組降低。SOCS2 優先在天然調節性T 細胞和誘導的Treg 中表達［9，17］。SOCS2 對維持iTreg的抗炎功能是必需的，可將SOCS2 作為Th2 型偏移疾病的一個潛在的治療靶點［18］。

本研究結果顯示，AR 組的SOCS2、IFN-γ 和FOXP3相對表達量顯著低于對照組，IL-5、IL-13、IL-4 相對表達量顯著高于對照組，與國內外相關研究結果相符［18-19］。臨床中常用VAS 來評估AR 癥狀的嚴重程度［20］。本研究發現，SOCS2 可作為臨床上評估AR 病情的一個參考指標。

綜上所述，SOCS2 在AR 組織中表達降低與多種因子相關，在AR 的發病機制中起重要作用。后期還將進一步研究細胞因子在AR 中的免疫功能和發病機制。