海藻異枝麒麟菜多糖對納米羥磷灰石晶體損傷小鼠血管平滑肌細胞的影響

韓 錦 姚智會 馬曉桃 桂保松

1.西安交通大學第二附屬醫院腎病內科，陜西西安 710004；2.西安交通大學第二附屬醫院心血管內科，陜西西安 710004

心血管疾病是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者首要死亡原因，其中血管鈣化（vascular calcification，VC）是心血管疾病的重要獨立危險因素［1-5］。CKD 患者鈣磷代謝紊亂導致血管平滑肌中羥基磷灰石（HAP）的形成，是VC 的關鍵啟動和進展因素［6-7］。本課題組以往研究［8］納米羥基磷灰石（nano-HAP）晶體可誘導小鼠血管平滑肌細胞（MOVAS）的細胞凋亡和壞死，加速VC 的發生。海藻異枝麒麟菜多糖（ESP）是一種以1,3-β-D-半乳吡喃糖和1,4-α-D-半乳吡喃糖作為基本骨架的直鏈硫酸酯多糖［9］，在醫療領域中應用廣泛。已有研究報道了海藻多糖在抗癌、免疫調節、抑制平滑肌細胞增生等方面的應用［10-13］。然而，目前尚沒有將ESP 用于預防和治療VC 方面的報道。本研究擬探討ESP 對nano-HAP 損傷的血管平滑肌細胞的保護作用，為研究ESP 防治CKD 的VC 治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試劑：nano-HAP（純度≥97%，粒徑＜100 nm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所，批號：20180730-1）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：20190831）；蘇木精（上海碧云天生物技術有限公司，批號：20150623）；ESP 由暨南大學生物礦化與結石病防治研究所歐陽建明教授贈予；MOVAS（廣州吉妮歐生物科技有限公司）。

儀器：CO2細胞培養箱（Thermo，311，美國）；超聲波細胞破碎儀（寧波新芝，JY92-IIN）；酶標儀（Thermo MultiskanMK3，美國）；顯微鏡下觀察（OLYMPUS，CKX41，日本）；多功能酶標儀（molecular devices，spectra-MaxM5，美國）；離心機（Thermo，Labofuge300，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 4 代MOVAS 用含10%胎牛血清的DMEM 培養液在37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞活力 實驗分為3 組：空白對照組：加入無血清培養液；模型組（nano-HAP 晶體處理組）：加入含有200 μg/mL nano-HAP 晶體的無血清培養液；實驗組（多糖處理組）：在含有200 μg/mL nano-HAP 晶體的無血清培養基中分別加入濃度為50、150、450 μg/mL 的ESP。分為低濃度（50 μg/mL）、中濃度（150 μg/mL）、高濃度（450 μg/mL）3 組。每個濃度設3 個復孔。5.0×104個/mL MOVAS 細胞懸液每孔100 μL/孔接種于96 孔細胞培養板中培養24 h 后，棄掉培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1 次。空白對照組換為無血清培養液，模型組和實驗組換為含nano-HAP 的無血清培養液。在培養2 h 后，實驗組加入不同濃度的ESP。繼續培養24 h 后用MTT 法測量各組細胞的活力，每孔加10 μL 的CCK-8 試劑，避光孵育1.5 h。用酶標儀在450 nm 處測量吸光度（A），求得3 個復孔A 值的平均值。

1.2.3 細胞LDH 釋放量檢測 實驗分組參照“1.2.2”進行。增設最大酶活性組，每個濃度設3 個復孔。5.0×104個/mL MOVAS 細胞懸液每孔200 μL/孔接種于48 孔細胞培養板中培養24 h 后，棄掉培養液，PBS 清洗1 次。空白對照組和最大酶活性組換為無血清培養液，模型組和實驗組換為含nano-HAP 的無血清培養液。在培養2 h 后，實驗組加入不同濃度的ESP。繼續培養24 h 后，各組均按LDH 試劑盒測試方法用酶標儀測定OD 值，求得3 個復孔A 值的平均值。LDH 釋放率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/（細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100%。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細胞形貌 實驗分組參照1.2.2 進行，MOVAS 細胞按濃度為1.5×105個/mL接種于12 孔培養板。把種好細胞的爬片用PBS 清洗2 次，用4%的多聚甲醛于室溫固定15 min，再用PBS清洗3 次，用蘇木精染色15 min，用水沖洗3 次，換用新鮮的蒸餾水再洗滌2 min，用伊紅染色液染色5 min，用水沖洗3 次，換用新鮮的蒸餾水再洗滌2 min，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示。比較采用單因素方差分析和t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESP 對nano-HAP 誘導的MOVAS 活力的影響

Nano-HAP 處理MOVAS 以及不同濃度多糖干預之后，各組細胞活力如圖1A 所示，空白對照組細胞活力設為100%。與空白對照組比較，模型組的細胞活力減少至（42.5±8.9）%，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。

加入不同濃度（50、150、450 μg/mL）的ESP 進行保護后，細胞活力升高到（51.3±5.8）%、（59.2±7.6）%、（72.1±9.8）%，與模型組比較，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01），低濃度組與中、高濃度組比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），中濃度組與高濃度組比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

2.2 ESP 降低nano-HAP 誘導損傷細胞的LDH 釋放率

將最大酶活性組LDH 釋放率設為100%，各組細胞的LDH 釋放率如圖1B 所示，空白對照組釋放率為（18.1±4.8）%，而模型組為（52.2±5.1）%，比較差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。隨著ESP 濃度從50 μg/mL升高到450 μg/mL，LDH 釋放量依次降低至（41.2±4.9）%、（35.8±5.8）%和（31.8±5.0）%，低濃度組與中、高濃度組比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），中濃度組與高濃度組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 HE 染色觀察細胞形貌

采用HE 染料對細胞進行染色可以觀察細胞的形態變化。空白對照組細胞形態光滑飽滿，呈長梭形，見圖2a（封四）。而模型組細胞體積縮小，胞質致密，見圖2b（封四），并且細胞數量減少。實驗組在加入不同濃度的多糖進行保護后，實驗組細胞形貌處在對照組與模型組之間，見圖2c～e（封四）。

圖1 ESP 對nano-HAP 誘導損傷MOVAS 細胞活力和LDH 釋放量的影響

3 討論

VC 是慢性腎臟病患者的常見并發癥。VC 是一個包含平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉換的類似骨形成的生理過程［14-15］。納米級磷酸鈣晶體能夠通過誘導人主動脈血管平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉換來誘導細胞鈣化，并且細胞鈣化程度與磷酸鈣晶體作用時間呈正相關［16-17］。在培養基中添加HAP 引起血管平滑肌損傷過程與體內HAP 誘導細胞損傷的過程類似。因此，本研究采用nano-HAP 晶體誘導MOVAS 損傷的模型，觀察了ESP 對血管平滑肌的保護作用。

本研究首先通過MTT 法檢測不同濃度ESP 對nano-HAP 晶體損傷的MOVAS 活力的影響，結果表明ESP 能夠抑制nano-HAP 晶體導致的MOVAS 損傷，且在50～450 μmol/L 呈明顯的濃度依賴性。多糖對細胞的修復或者保護所用的濃度范圍很廣。Li 等［18］研究顯示濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL 的Morchella esculenta 多糖抑制了H2O2引起的A549 細胞的凋亡與氧化應激；Liang 等［19］也發現在濃度范圍為5～1000 μg/mL 的紅藻多糖對HUVEC 無毒性并且刺激細胞的增殖，當濃度為800 μg/mL 時，細胞的活力達到了140%。因此本研究選擇了50、150、450 μg/mL。

LDH 是細胞漿內酶，當細胞損傷調亡而造成的細胞膜通透性發生改變時，胞內的LDH 會透過細胞膜釋放到細胞外，因此LDH 的檢測可作為評價細胞膜破壞程度的重要指標［20］。本研究通過檢測從細胞釋放到培養液中的LDH 的含量，定量分析了加入nano-HAP 對細胞膜的損傷程度，發現nano-HAP 晶體可破壞MOVAS 細胞的細胞膜，導致LDH 釋放增加。而加入不同濃度的ESP 多糖后能明顯減少LDH 的釋放量。提示ESP 對MOVAS 細胞有保護作用，且在450 μg/mL 濃度內，隨著ESP 濃度增加，保護效果增強。

本研究采用HE 染料對細胞進行染色觀察細胞的形態變化。結果發現，經過nano-HAP 損傷后的細胞體積縮小，細胞質濃縮，而加入不同濃度的多糖進行保護后，實驗組細胞形貌處在空白對照組與模型組之間，且ESP 濃度越高，保護作用越強。

綜上所述，本研究采用nano-HAP 晶體誘導MOVAS損傷的模型，觀察了ESP 對血管平滑肌的保護作用。結果顯示，ESP 通過抑制HAP 誘導的血管平滑肌細胞活力下降、LDH 釋放率增高，從而發揮其對血管平滑肌細胞的保護作用。因缺乏體內實驗的驗證，本研究的結果具有一定的局限性，但是為研究ESP 抗血管鈣化的機制提供了一定的理論基礎。