貴州油茶葉枯病病原鑒定研究

秦紹釗 王建偉 張柱亭

摘 要 擬盤多毛孢菌屬真菌侵染的寄主種類多、范圍廣，可引起多種經濟作物和觀賞植物的多類病害，病征具有多樣性。在前期對貴州省油茶葉枯病的研究過程中，分離到一個擬盤多毛孢菌的新致病菌KLXY-7-2。通過病原菌的分離與純化、形態學鑒定和微管蛋白基因（TUB2）構建系統發育樹等多種檢測方法，KLXY-7-2菌鑒定結果為木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。病原菌與擬盤多毛孢屬EF055226.1、EF055231.1真菌聚為一個獨立的進化分支，且置信度為99%。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），在油茶葉枯病的相關研究屬于首次報道，可為進一步明確該病原菌的發生規律及預防時期提供科學依據。

關鍵詞 葉枯病;擬盤多毛孢;形態學;新種;分子鑒定

中圖分類號：S794.4 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.26.067

油茶（Camellia oleifera）作為木本油料作物，在貴州省栽培歷史悠久，是發展農業農村經濟的重要支撐力量。擬盤多毛孢屬真菌是多種經濟作物和觀賞植物病害的重要致病菌，感病后的典型病狀為葉枯，感病葉片壞死面積達整片葉1/2以上。國內報道的擬盤多毛屬真菌侵染油茶的菌種主要有茶擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）和小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）[1-2]。

近年來，擬盤多毛孢菌的鑒定方法逐漸完善和規范，依據生物學、柯赫氏法則、系統發育學等特征鑒定種類，結果較準確和可信，逐漸解決了種類鑒定上易混淆的問題。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在貴州油茶病害研究中未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

2016—2018年采集油茶葉枯病葉片標本于凱里市、黎平縣、天柱縣、錦屏縣及黃平縣，分別集中于在6—8月，10—11月采集病樣，從病葉的病健交接處經組織分離，用PDA培養3～5 d后，4 ℃冰箱內保存備用。葉枯病病斑呈不規則狀，紅褐色至灰褐色，連片成大枯斑（如圖1）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

常規組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無菌水漂洗干凈，PDA培養基純化培養，置于4 ℃下保存備用。

1.2.2 病原菌的形態鑒定

取5 mm菌餅在PDA平板26～28 ℃黑暗16 h培養，2～5 d連續觀察菌落的形態、顏色，并取10 μL孢子懸浮液在光學顯微鏡下觀察記錄其大小及形態特征。

1.2.3 分子鑒定與系統發育分析

取50 mg菌絲經液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。引物如下：Bt2a 5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，Bt2b 5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3。

將測序的rDNA-TUB2與GenBank中相關菌株序列利用ClustalX 1.83軟件進行比對分析。在基因系統發育分析結果中選出與各分離菌株相似度較高的相應序列，將所選序列與GenBank中擬盤多毛孢菌的基因序列采用MEGA 7.0.14軟件中的最大簡約法（MP）做聚類分析，所有堿基賦予相同權重，自展循環1 000次，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌菌落與形態特征

在PDA培養基上，培養菌落近圓形，該菌株外觀呈白色，菌絲致密，整個菌株生長較慢，中央隆起，氣生菌絲呈茸毛狀（如圖2-A）;培養皿反面菌落呈黃色，有褶皺，黃色菌上長有白色菌絲，菌絲較短（如圖2-B）。22 ℃培養5天后，菌落和菌絲表面可見散布分生孢子盤。

分生孢子呈棍棒狀紡錘形，5個細胞，長（20.5～

27.5）μm×（5.2～7.6）μm;中間2個有色細胞顏色較深，長15.7～18.1 μm，兩端細胞色淺;孢子頂端有2～3根附屬絲，長10.9～16.8 μm;基部附屬絲長3.9～5.8 μm。

根據分離物的菌落和分生孢子形態特征，初步鑒定為木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）（如圖2）。

2.2 分子鑒定

本研究以3個分離菌DNA為模板，對其微管蛋白TUB2基因進行PCR擴增并測序。經NCBI Blastn確定3個菌株同屬于擬盤多毛孢屬木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），與形態學鑒定的結果一致。

代表菌株KLXY-7-2的TUB2基因序列與擬盤多毛孢屬其他同屬菌株序列經最大簡約法（MP）構建的系統發育樹中，與2株木防已擬盤多毛孢菌（EF055226.1，EF055231.1）親緣關系最近，以100%的支持率（Bootstrap=100%）聚為一個獨立的進化分支（如圖3）。因此，根據分離所得鑒定結果將KLXY-7-2菌株鑒定為木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。

3 結論與討論

通過擴增擬盤多毛孢菌的TUB2基因序列，將代表菌株KLXY-7-2序列與GenBank中已有序列做比對，聚類分析與序列分所得析結果顯示，擬盤多毛孢菌形成2個大的聚類群。該菌株形態特征與趙光材等[3]、吳文能等人[4]

描述的木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）基本一致。此外，通過病原菌的分離與純化、形態學鑒定和微管蛋白基因（TUB2）構建系統發育樹等多種檢測方法，對引起貴州油茶葉枯病的病原物進行了系統性鑒定，分離菌株的基因序列與參考序列號的相似率為99%。因此，從形態學和分子方面證明該病原菌是木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。在明確該致病菌種類后，后期將在室內和田間開展篩選低毒高效殺菌劑的研究工作，為油茶病害的綠色防控提供科學依據。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在貴州油茶病害研究中未見報道。

由于擬盤多毛孢屬真菌與寄主植物種類之間無特異專化性，植物中普遍存在，種間形態特征差異不顯著，區分難度大，對病原菌鑒定與病害防治造成一定的困難，ITS1-TUB2序列相結合對擬盤多毛孢屬絕大多數種類起到較好的鑒別作用。因此，今后對病原菌采用形態特征結合多個基因位點的系統鑒定很有必要。

參考文獻：

[1] 盧東升，黃新華，代兵.信陽市油茶病害及其病原鑒定[J].東北林業大學學報，2012，40（5）：83-85，111.

[2] 牛曉慶，陳良秋，付登強，等.油茶葉枯病菌的鑒定及生物學特性研究[J].熱帶作物學報，2013，34（2）：352-357.

[3] 趙光材，李楠.擬盤多毛孢屬在云南的34個種[J].東北林業大學學報，1995（4）：21-27.

[4] 吳文能，雷霽卿，李江闊，等.藍莓采后病害病原菌分離鑒定及抑菌藥劑篩選[J].北方園藝，2019（7）：58-64.

（責任編輯：趙中正）