鐵代謝相關蛋白在燒傷后增生性瘢痕中的表達

李冬軍 趙連魁 李明 楊建民

[摘要]目的：探討燒傷后增生性瘢痕患者中鐵代謝相關蛋白的表達情況。方法：組織標本均來自2016年-2018年石家莊市第一醫院燒傷整形外科住院患者。患者分三組：正常皮膚組、萎縮性瘢痕組、增生性瘢痕組。后兩組患者分別采集瘢痕及其自身正常皮膚標本。術中采集標本，應用電感耦合質譜分析儀測定三組標本中組織鐵含量。免疫組織化學染色檢測增生性瘢痕中鐵代謝相關蛋白轉鐵蛋白受體1 （transferrin receptor 1，TfR1）、鐵蛋白（ferritin，FTL）、二價金屬離子轉運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）、膜鐵轉運蛋白1（ferroportin 1，FPN1）等在增生性瘢痕中的表達。結果：三組正常皮膚組織中組織鐵含量比較差異無統計學差異（P>0.05）。增生性瘢痕組：增生性瘢痕組織比自身正常皮膚組織中組織鐵含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。免疫組化顯示增生性瘢痕組中增生性瘢痕組織及自身正常皮膚組織中均有鐵代謝相關蛋白的表達，多表達于胞漿中，在表皮層表達較強。其中DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在增生性瘢痕組織中表達量高于其自身正常皮膚組織（P<0.05）;TfR1在增生性瘢痕組織中表達量卻降低（P<0.05）。結論：增生性瘢痕組患者瘢痕局部鐵元素沉積過多，進而細胞內可能通過IRP/IRE系統調節鐵的攝取和釋放，而且推測主要依賴于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。

[關鍵詞]增生性瘢痕;萎縮性瘢痕;轉鐵蛋白受體1;鐵蛋白;二價金屬離子轉運蛋白1;膜鐵轉運蛋白1

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）12-0079-04

Expression of Iron Metabolism Related Proteins in Hypertrophic Scars after Burn

LI Dong-jun1，ZHAO Lian-kui1，LI Ming1，YANG Jian-min2

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital of Shjiazhuang，Shijiazhuang 050011，Hebei，China;2.Department of Plastic Surgery，Tsinghua Changgeng Hospital，Beijing 102218，China）

Abstract： Objective ?To study the expression of iron metabolism related proteins in hypertrophic scars of burn patients. Methods ?Tissue specimens were collected from inpatients in burn and plastic surgery department of Shijiazhuang First Hospital from 2016 to 2018. The patients were divided into three groups： the normal skin group， the atrophic scar group and the hypertrophic scar group. In the latter two groups， scars and normal skin specimens were collected. Specimens were collected during the operation. Tissue iron content in three groups of specimens was determined by inductively coupled mass spectrum analyzer. Immunohistochemical staining was used to detect the expression and localization of the iron metabolism related protein oftransferrin receptor 1 （TfR1）， ferritin （FTL）， divalent metal transporter 1 （DMT1） and membrane iron transporter 1 （FPN1） in hypertrophic scars and its own normal skin specimens of the hypertrophic scar group. Results ?There was no significant difference in iron content in normal skin tissue between the three groups （P>0.05）. The iron content in hypertrophic scar tissue in the hypertrophic scar group was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that iron metabolism related proteins were expressed in hypertrophic scar tissue and normal skin tissue of the hypertrophic scar group. Most of them were expressed in the cytoplasm. The expression was strong in the epidermis. The expression of DMT1 （±IRE）， FPN1 and FTL in hypertrophic scar tissue was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. The expression of TfR1 in hypertrophic scar tissue was decreased （P<0.05）. Conclusion ?In hypertrophic scar patients， excessive iron deposition in scar area may lead to intracellular regulation of iron uptake and release through IRP/IRE system， and it is presumed that the role of TfR1 and FPN1 rather than DMT1 （±IRE） is mainly dependent on the role of TfR1 and FPN1.

Key words： hypertrophic scar; atrophic scar; transferrin receptor 1; ferritin; divalent metal transporter protein 1; ferroportin 1

增生性瘢痕是由創傷、手術等引起，是以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質過度沉積為特征的病理性瘢痕。臨床上增生性瘢痕是嚴重燒、創傷患者后期恢復所要面臨的主要問題[1]。增生性瘢痕的預防和治療是燒傷整形領域研究的熱點和難點。已有學者證實微量元素不僅影響機體生長發育還可對組織增生修復產生一定作用，如Muri[2]在對瘢痕的研究中提出，病理性瘢痕的發生可能與瘢痕中缺乏某種物質有關;秦澤蓮等[3]發現增生性瘢痕組織中微量元素含量較自身正常皮膚減少，認為微量元素的減少可能與增生性瘢痕的形成有關。但直到目前為止，其具體的發生機制仍不明確。本研究通過檢測燒傷患者增生性瘢痕中的鐵元素含量及鐵代謝相關蛋白的表達狀況，分析鐵代謝相關蛋白表達的變化特點與增生性瘢痕形成的關系，旨在為臨床治療燒傷增生性瘢痕提供新的思路。

1 ?材料和方法

1.1 病例資料：組織標本均來自2016年-2018年石家莊市第一醫院燒傷整形外科住院患者。患者分3組：正常皮膚組（A組）：取自外傷及美容手術受術者，取其正常皮膚標本，共15例;萎縮性瘢痕組（B組）：選取無任何癥狀，因單純美容需求行瘢痕切除術的患者15例;增生性瘢痕組（C組）：選取具有增生性瘢痕典型癥狀體征的患者15例。患者均無職業性金屬元素接觸史和家族性瘢痕增生史;瘢痕患者術前未曾采用任何防治瘢痕的藥物及相關治療;患者均簽署知情同意書。術前采血，術中采集標本。

1.2 主要試劑：兔抗大鼠多克隆FPN1一抗、鼠抗人單克隆TfR1一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1+IRE一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1-IRE一抗、兔抗人多克隆β-actin一抗均為Alpha Diagnostic International，USA產品;HRP-藕聯的山羊抗小鼠IgG單抗、HRP-藕聯的山羊抗兔IgG單抗為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，其他試劑為國產分析純產品。

1.3 標本采集及留存：萎縮性瘢痕組及增生性瘢痕組患者分別采集瘢痕及其自身正常皮膚標本，瘢痕分別取材于面頸部、肩背部、腋窩部及上肢;正常皮膚取自同一患者全厚皮片移植剩余部分，取材于上肢、腹部及下肢。每例標本取材后均立即分為兩份，一份置于4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片;另一份立即放入液氮中凍存備用。

1.4 組織鐵測定：皮膚和瘢痕組織充分解凍后用雙蒸去離子水沖洗6次，自然干燥24h后稱重。分別取樣0.3g置于消化器中，加入純硝酸2ml，70℃水浴中加熱4h，待樣品溶解后繼續100℃水浴加熱2～3h，使消化器中溶液體積保持0.5ml;加入高氯酸0.1ml，并置于70℃水浴中加熱1～2h至溶液呈清亮;將溶液轉移入定容管內，用雙蒸去離子水分別定容5ml。應用電感耦合質譜分析儀測定定容液中Fe元素的含量。按以下公式計算樣品中Fe含量（μg/g）：定溶液微量元素含量（μg/g）×定容液體積（5ml）/樣品重量（g）[4]。

1.5 免疫組織化學染色：免疫組化按SP免疫組化試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。TfR1鼠抗人單克隆抗體稀釋度為1：100，DMT1+IRE、FPN1、FTL兔抗人多克隆抗體稀釋度為1：200。PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷陽性表達在細胞膜或胞漿內，呈棕黃色顆粒。染色強度半定量分析：0（無表達），1（弱表達，染色較淺），2（染色中等程度），3（染色較深）。免疫組化染色強度評估由兩位病理醫師獨立完成。

1.6 統計學分析：采用Graphpad 5.0統計學處理軟件進行分析，采用配對檢驗方法及非參數單因素AVONA分析，實驗結果用（x?±s）表示。

2 ?結果

2.1 組織鐵含量：正常皮膚組、萎縮性瘢痕組、增生性瘢痕組正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）分別為：49.65±6.12，48.36±2.94，47.92±4.21，組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。萎縮性瘢痕組：萎縮性瘢痕與其自身正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）為：45.37±4.15，48.36±2.94，二者比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。增生性瘢痕組：增生性瘢痕與其自身正常皮膚中組織鐵含量（μg/g）為：69.71±4.53，47.92±4.21，二者比較，瘢痕組織鐵含量增高，差異具有統計學意義（P<0.01）。

2.2 免疫組化檢測增生性瘢痕組織中鐵代謝相關蛋白表達量的變化：在所有病例中增生性瘢痕組織較其正常皮膚組織中FTL、DMT1+IRE、DMT1-IRE、FPN1表達顯著增高。增生性瘢痕及正常皮膚組織中表達較廣泛，在表皮層表達相對較強，在真皮及皮下組織中表達較弱。FTL主要表達在胞漿中。DMT1+IRE、DMT1-IRE及FPN1主要表達在胞漿、胞膜中，胞核內表達相對較弱。而在所有病例中增生性瘢痕組織較其正常皮膚組織中TfR1表達顯著降低。增生性瘢痕及正常皮膚組織的表皮層表達相對較強，真皮及皮下組織中表達相對較弱。TfR1在細胞中主要表達在胞漿中。

3 ?討論

研究發現，在嚴重創傷尤其是中、重度燒傷后的早期，患者體內的微量元素含量往往有較大異常。另有研究發現增生性瘢痕組織中的鈣、鎂、鋅、鐵和銅含量較其自身正常皮膚的含量下降。其中鐵是人體的必需微量元素，參與體內眾多的生化反應，鐵代謝紊亂可引起多種常見疾病[5-7]。鐵作為維持機體生命活動和組織細胞新陳代謝的重要物質，直接或間接參與到創傷修復過程中的細胞免疫、傷口愈合及抗氧化反應等多個環節[8-9]，過多或不足都將會影響創面的愈合[10]。目前，已有的研究都集中于增生性瘢痕中各種微量元素較正常皮膚中的含量的變化的研究，而有關增生性瘢痕中鐵代謝相關基因蛋白表達的變化鮮有研究，本實驗就增生性瘢痕和鐵代謝相關蛋白之間的聯系作一探討。

已知，細胞內鐵水平能夠直接通過鐵調節蛋白 （iron regulatory protein，IRP）、鐵反應元件 （iron resposive element，IRE） 調節鐵代謝相關蛋白的表達[11]。鐵代謝相關蛋白有：轉鐵蛋白受體1 （TfR1）、鐵蛋白（Fn）、二價金屬離子轉運蛋白1（DMT1）、膜鐵轉運蛋白1（FPN1）等。正常生理情況下，當細胞內鐵含量較高時，胞內鐵可與IRP結合，從而抑制IRP與IRE結合的活性，這樣IRP不能與DMT1和TfR1 3'端的IRE結合，失去對DMT1和TfR1 mRNA的保護作用，其mRNA被降解，阻止二者的轉錄，DMT1、TfR1蛋白表達水平下降，細胞從胞外攝入鐵的能力隨之下降;此時FPN1 5'IRE也不能與IRP結合，FPN1的翻譯抑制被解除，FPN1大量表達，增加鐵從細胞內向外的輸出[4]。反之，當細胞內鐵水平較低時，與IRP結合的鐵和IRP分離，激活IRP與IRE結合活性，IRP即與DMT1和TfR1 3'端的IRE結合，保護DMT1和TfR1 mRNA，使其免被降解，DMT1、TfR1蛋白水平表達上升，從而增加細胞鐵攝取，此時FPN1 5'IRE與IRP結合，抑制FPN1的翻譯，FPN1表達隨之下降，減少鐵向細胞外的輸出。鐵代謝相關蛋白通過上述原理達到調節細胞內鐵水平的作用[12]。

本實驗結果顯示增生性瘢痕組患者瘢痕局部組織鐵含量升高明顯，免疫組織化學染色發現鐵蛋白FTL的表達量也上升，這二者都提示瘢痕局部鐵元素可能沉積過多。在瘢痕異常增生情況下，成纖維細胞、膠原細胞等細胞通過IRP/IRE調節系統攝入了大量的鐵，來滿足瘢痕內各種細胞的生長增殖及抗氧化的需要;然而攝入的鐵過多，使胞內鐵過載，在IRP/IRE調節系統作用下，TfR1、DMT1（±IRE）表達量下降，從而減少細胞鐵攝入;FPN1表達升高，進一步增加鐵釋放，以維持細胞內鐵穩態。但實驗中發現TfR1表達量下降，而DMT1（±IRE）表達卻增高，FPN1表達升高，分析其原因可能是TfR1在皮膚組織中本底表達低[13]，TfR1由于細胞內鐵的增加而表達進一步下降。另一方面，這還可能因增生性瘢痕中其他的二價金屬離子Zn、Cu等的含量較低[2]，而DMT1（±IRE） 是細胞中主要的二價金屬轉運體，對這些微量元素亦有攝取作用，為維持這些元素的細胞內穩態，細胞會通過增加DMT1（±IRE）的表達盡量攝取所需要的Zn、Cu等。因此推測在皮膚組織中，通過胞內的IRP/IRE調節系統，鐵的攝取釋放在主要依賴于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。除此之外，也可能還有其他的未知調節因素在鐵代謝相關蛋白的表達過程中起作用，且作用大于IRP/IRE調節系統。

綜上所述，本研究通過免疫組織化學的方法研究了鐵代謝相關蛋白TfR1、DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在燒傷后增生性瘢痕組織及正常皮膚組織中的表達情況，結果表明，DMT1（±IRE）、FPN1及FTL在增生性瘢痕組織中高表達，TfR1表達量卻下降。通過本研究，初步證實鐵代謝相關蛋白各自在增生性瘢痕組織中的表達情況，為進一步從細胞分子水平理解認識增生性瘢痕的發生發展提供了新方向，將為增生性瘢痕的治療提供新的途徑、新的靶點的理論依據。本研究僅初步探討了鐵代謝相關蛋白在增生性瘢痕組織中的表達情況，樣本量較少，仍需增加樣本量對上述結論進行驗證。

[參考文獻]

[1]蔡景龍.現代瘢痕學[M].北京：人民衛生出版社，2008：103-104.

[2]Muri IF.On the nature of keloid and hypcrtrophic scars[J].J Br Plast

Surg，1990，43（1）：61-69.

[3]秦澤蓮，繆亦，牛星熹.增生性瘢痕的金屬元素含量變化[J].中華整形外科雜志，2001，17（2）：93-95.

[4]Ding H，Yan CZ，Shi H，et al.Hepcidin is involved in iron regulation in the ischemic brain[J].PLoS One，2011，6（9）：e25324.

[5]Naomichi Abe，Takuma Tsuchida，Shin-Ichiro Yasuda，et al.Dietary iron restriction leads to a reduction in hepatic fibrosis in a rat model of non-alcoholic steatohepatitis[J].Biol Open，2019，8（5）.pii：bio040519.

[6]Ke Y，Qian ZM.Brain iron metabolism： neurobiology and rochemistry[J].Prog Neurobiol，2007，83（3）：149-173.

[7]Dev S，Babitt JL.Overview of iron metabolism in health and disease[J].Hemodial Int，2017，21（Suppl 1）：S6-S20.

[8]Dixon SJ，Stockwell BR.The role of iron and reactive oxygen species in cell death[J].Nat Chem Biol，2014，10（1）：9-17.

[9]Berger MM.Antioxidant micronutrients in major trauma and burns： evidence and practice[J].Nutr Clin Pract，2006，21（5）：438-449.

[10]Lynam EC，Xie Y，Dawson R，et al.Severe hypoxia and malnutrition collectively contribute to scar fibroblast inhibition and cell apoptosis[J].Wound Repair Regen，2015，23（5）：664-671.

[11]Pantopoulos K.Iron metabolism and the IRE/IRP regulatory system： an update[J].Ann N Y Acad Sci，2004，1012：1-13.

[12]Anderson GJ，Frazer DM.Current understanding of iron homeostasis[J].Am J Clin Nutr，2017，106（Suppl 6）：1559S-1566S.

[13]Berger MM，Shenkin A.Trace element requirements in critically ill burned patients[J].J Trace Elem Med Biol，2007，21（Suppl 1）：44-48.

[收稿日期]2019-04-27

本文引用格式：李冬軍，趙連魁，李明，等.鐵代謝相關蛋白在燒傷后增生性瘢痕中的表達[J].中國美容醫學，2019，28（12）：79-82.