重訪乙型肝炎病毒感染腎臟的意義

朱冬，楊橙，童舒平，劉少軍，王勇翔

1. 復旦大學上海醫學基礎醫學院教育部、衛健委、醫科院醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032； 2. 復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上海市器官移植重點實驗室，上海 200032； 3. 復旦大學附屬華山醫院腎臟科，上海 200040

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，基因組全長約 3.2 kb，是感染人的最小DNA病毒。迄今為止，全球約有2.5億人感染了HBV[1]。當HBV感染者血清中的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)持續存在超過6個月，即為慢性感染。慢性乙型肝炎患者罹患終末期肝病(包括肝硬化和肝癌)的風險大大增加[2]。一般認為，HBV感染的主要靶器官為肝臟。但流行病學研究顯示，慢性乙型肝炎患者罹患慢性腎病和腎癌的風險也顯著增加[3-5]。雖然慢性乙型肝炎相關性腎炎主要由免疫復合物(如HBsAg和抗-HBs復合物)沉積所致[6]，但許多研究已發現HBV感染標記[如HBsAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)、HBV RNA和DNA]存在于慢性乙型肝炎患者的腎臟細胞[7-10]，特別是近來有證據顯示HBV功能性受體鈉離子/?；悄懰峁厕D運蛋白(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)和支持HBV RNA轉錄的轉錄因子均在腎臟中表達[11-12]。因此，對于腎臟是否為HBV感染、表達和復制的另一靶器官，值得進一步探討。

目前，用于治療慢性乙型肝炎的藥物包括α干擾素、聚乙二醇化α干擾素和核苷(酸)類似物，但它們都不能清除共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)而無法達到病毒學治愈的目標[13]。因此，功能性治愈是當前慢性乙型肝炎治療的目標，主要指標是HBsAg消失[13]。但當前的藥物治療極少能達到使HBsAg消失的目標(干擾素治療3%～7%，核苷(酸)類似物治療每年約1%)[13]。這也提示HBV可能潛伏在其他器官中。若腎臟是HBV感染、表達和復制的另一靶器官，HBV與腎臟細胞的相互作用、腎臟的抗病毒免疫反應將是全新研究領域。此外，現有治療藥物在腎臟內的抗病毒效應也值得評估。本文就HBV在肝臟內建立感染的決定因素、感染腎臟的可能性及乙型肝炎相關性腎炎的診斷和治療進行簡要綜述。

1 HBV感染和復制

HBV為包膜病毒，其包膜含有大(large，L)、中(middle，M)和小(small，S)3種表面蛋白，合稱為HBsAg，其中由226個氨基酸(amino acid，aa)組成的S蛋白豐度最高。目前認為S蛋白為4次跨膜蛋白，其99～169位氨基酸位于第2和第3個跨膜區且暴露在病毒表面，因包含多個能誘生中和性抗體的線性和構型表位而被稱作抗原環(antigenic loop，AGL)，M蛋白在S蛋白N端多出55個氨基酸的PreS2區，而L蛋白則在S蛋白N端多出108或119個氨基酸的PreS1區和PreS2區。M蛋白的功能未知，L蛋白PreS1區第2位甘氨酸豆蔻?；?myristoylation)對L蛋白與NTCP的結合至關重要[14-15]。HBV先通過AGL與肝細胞表面肝素硫酸蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans，HSPG)結合，使病毒在肝細胞表面富集[16-17]，再通過PreS1 N端第2～48位氨基酸與NTCP結合介導HBV進入肝細胞[15,18]。隨后，病毒脫去包膜，釋放核衣殼(nucleocapsid)，后者通過微管運輸到細胞核，再脫殼將包裹的松弛環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)釋放入核。rcDNA可能借助細胞內的DNA修復系統而轉化成cccDNA[19]。cccDNA包含2個增強子、4個啟動子等轉錄調控元件[20]，一些肝細胞轉錄因子識別和結合這些調控元件而招募細胞的RNA聚合酶Ⅱ等轉錄復合物[21]。RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA為模板轉錄出4組不同長度(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb)的病毒RNA。3.5 kb前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)編碼核心蛋白和聚合酶。聚合酶順式結合pgRNA 5′端莖環結構(ε)并與核心蛋白二聚體及細胞因子(如Hsp90等)一起包裝形成核衣殼。與此同時，聚合酶以pgRNA為模板將第1個脫氧核苷酸(dT)共價連接至聚合酶TP區第63位酪氨酸(該過程稱為蛋白引發)[22]，從而起始病毒DNA復制。在核衣殼內，聚合酶依次以pgRNA為模板，通過反轉錄形成負鏈DNA，再降解pgRNA，并以負鏈DNA為模板合成正鏈DNA。3.5 kb的前C區RNA(precore RNA，pcRNA)編碼乙型肝炎 e 抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)。2.4 kb和2.1 kb mRNA分別指導翻譯L和M/S包膜蛋白。成熟的核衣殼被L、M和S包膜蛋白包裹形成完整的病毒顆粒，后者通過多囊泡體相關途徑分泌出胞[23-25]。S包膜蛋白也以亞病毒顆粒的形式大量釋放，其血中的濃度是完整病毒顆粒的1 000～10 000倍，是HBsAg的主要來源。

2 HBV感染人肝臟的決定因素

HBV的嗜肝性由諸多因素決定。首先，暴露于HBV表面的L蛋白PreS1區與肝細胞表面的NTCP特異性作用是關鍵。最近，不同種屬NTCP與PreS1結合能力測定及表達人NTCP的不同種屬肝細胞的HBV易感性檢測實驗提供了重要證據。盡管來自人、小鼠、大鼠、狗、豬和獼猴的NTCP高度同源，但獼猴NTCP第157～165位氨基酸不同于人NTCP，導致PreS1多肽不能結合獼猴NTCP及HBV不能感染獼猴肝細胞[26]。小鼠NTCP雖然能結合Pres1多肽，但不介導HBV感染小鼠肝細胞，這主要是小鼠與人NTCP第84～87位氨基酸序列差異所致[15,18]。通過腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體將人NTCP基因導入小鼠、大鼠、狗、豬和獼猴原代肝細胞，促使這些細胞表達人NTCP。HBV攻毒實驗發現只有表達了人NTCP的豬和獼猴原代肝細胞建立了感染，而小鼠、大鼠、狗的原代肝細胞不能被感染[26]。如果將穩定表達人NTCP的小鼠肝細胞系與人HepG2細胞融合，這樣的融合細胞卻能支持HBV感染[27]。這些結果提示，除了NTCP，還有其他宿主因子對HBV建立感染至關重要。

肝細胞表達的肝富集轉錄因子結合cccDNA的增強子和啟動子而促使HBV RNA轉錄是HBV嗜肝性的另一個重要因素。通過啟動子活性檢測以及點突變和缺失突變、轉錄調控序列與轉錄因子結合的凝膠遷移等實驗發現，HNF4α、HNF3和RxRα/PPARα等是促使HBV RNA轉錄的關鍵轉錄因子[28-31]。非肝來源的NIH 3T3細胞不支持HBV轉錄和復制，但若將HNF4α或RxRα/PPARα與含 1.3 倍體HBV基因組表達質粒共轉染該細胞，通過RNA/DNA印跡法證明了HBV RNA轉錄和DNA復制[28]。經尾靜脈高壓水動力注射將HBV表達質粒導入小鼠(如BALB/c和C57BL/6品系)肝臟可起始病毒復制，因此小鼠肝細胞包含支持HBV轉錄所需的轉錄因子[32]。但表達人NTCP的小鼠或小鼠原代肝細胞仍不能被HBV感染[27,33]，提示從HBV侵入肝臟到cccDNA形成的某些環節在正常小鼠肝細胞內無法完成，其中可能的關鍵宿主因子還有待鑒定和研究。

3 腎臟具備HBV感染和復制的因素

眾多研究通過免疫組織化學、原位HBV RNA和DNA雜交等技術發現了HBV感染標記(如HBsAg、HBcAg、HBV RNA和DNA)存在于慢性乙型肝炎患者的腎小球內皮細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞[7-10]。這些腎臟細胞內的HBV標記可能是細胞吞噬血液中的病毒顆粒(或與抗體形成復合物)所致，也可能由整合在染色體上的HBV DNA所編碼，或HBV感染這些腎臟細胞所致。HBV RNA和DNA陽性提示腎臟細胞能支持HBV轉錄和DNA復制。提取腎組織總DNA進行DNA印跡法，發現大部分HBV DNA顯著長于3.2 kb，提示HBV DNA整合于宿主細胞染色體，也有少部分HBV DNA為復制中間體[34]。但這些研究缺少嚴謹的分子生物學實驗以檢測驅動HBV復制的天然模板——cccDNA，因此HBV是否在腎臟建立感染還有待證實。

用含1.2或1.3倍HBV基因組的質粒構建轉基因C57BL/6小鼠，轉基因鼠的肝臟和腎臟都高表達前基因組RNA和PreS/S mRNA[35-36]，這些病毒RNA再編碼病毒復制和組裝所需的核心蛋白、聚合酶、包膜蛋白等，通過DNA印跡法等技術證明HBV在轉基因鼠肝臟和腎臟復制[35,36]。本研究團隊曾構建了整合HBV單倍體基因組的轉基因小鼠[37]，雖然該系小鼠無HBV顆粒產生，但肝和腎小管上皮細胞都表達了HBsAg和核心蛋白[37]，通過蛋白免疫印跡和組織化學技術發現肝細胞富集的轉錄因子如HNF4、HNF3、HNF1、RxRα/PPARα等在腎臟表達[12,38-41]。這些證據表明，腎臟提供了支持HBV RNA轉錄和DNA復制的必要因素。此外，用HBV表達質粒轉染HEK-293人胚腎細胞起始HBV轉錄和復制，提取細胞總DNA，DNA印跡法檢測發現該細胞支持cccDNA形成[42]，提示腎臟細胞可提供必需的宿主因子，促使HBV核衣殼入核及將rcDNA修復成cccDNA。

作為HBV低親合力受體的HSPG(如Glypican 5)[16-17]在肝臟和腎臟(尤其是腎小管上皮細胞)均表達[43-44]。通過免疫組織化學技術發現，作為HBV高親合力受體的NTCP在人肝臟和腎小管上皮細胞高表達(數據來源于蛋白定位數據庫https://www.proteinatlas.org)。通過蛋白免疫印跡技術發現，NTCP在小鼠肝臟、腎臟和胰臟表達[11]。這些數據提示，人腎臟因表達NTCP而可能成為HBV感染的另一重要靶器官。

4 乙型肝炎相關性腎炎

Combes于1971年最先在1例膜性腎病患者的腎活檢標本中發現HBsAg沉積在腎小球基底膜上[45]。乙型肝炎相關性腎病主要包括乙型肝炎相關膜性腎病和乙型肝炎相關膜增生性腎小球腎炎[6]，還包括乙型肝炎相關性冷球蛋白血癥的腎損害及在我國尚無報道的乙型肝炎相關性結節性多動脈炎。我國于1989年將乙型肝炎相關性腎病命名為HBV相關性腎小球腎炎。

目前，乙型肝炎相關性腎炎的診斷依據包括：①血清HBV標記陽性；②患腎病或腎炎并除外其他腎小球疾病；③腎小球中有一種或多種 HBV 抗原沉積；④腎臟病理改變，絕大多數為膜性腎病，少數為膜增生性腎炎和系膜增生性腎炎。根據2008年中華醫學會兒科學分會腎臟病學組指南，乙型肝炎相關性腎炎的確診標準為：同時具備上述第①、②和③條；同時具備上述第①、②條依據，且第④條依據中為膜性腎??；個別患者具備上述第②、③條依據，血清HBV標記陰性也可確診。僅具備第①和②條但不具備③時，不能進行診斷。

腎活檢病例中，血清HBsAg陽性比例約為6.8%(復旦大學附屬華山醫院2017—2018年統計數據)，與人群中HBV感染率相當。約7.6%的血清HBsAg陽性患者腎組織中至少一種HBV抗原陽性，按以上診斷標準可診斷為乙型肝炎相關性腎炎。

但現行診斷標準并非十全十美。例如，腎組織活檢HBV陽性并不能完全等同于HBV感染就是腎炎的病因；而腎組織中HBV抗原陰性，也不能完全排除其作為腎炎的病因。在臨床實踐中，僅根據腎小球中滯留的HBV標記進行乙型肝炎相關性腎炎的診斷尚存在假陽性或假陰性，還需更多證據來輔助診斷。例如，通過抗病毒治療使血清HBV抗原和病毒DNA拷貝數下降，如果腎病獲得緩解則支持乙型肝炎相關性腎炎的診斷，如果腎病并無改善則可能不支持該診斷。此外，一些生物標記可提高乙型肝炎相關性腎炎診斷的特異性。最近，多項研究表明，磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor，PLA2R)的抗體是特發性膜性腎病的有效標記，可用作HBV抗原-抗體沉積合并原發性膜性腎病與HBV抗原-抗體沉積所致膜性腎病的鑒別診斷[46-50]。

乙型肝炎相關性腎炎治療以抗病毒治療為主[6]。兒童首選干擾素，成人則多選擇核苷類抗病毒藥物，不主張盲目使用免疫抑制劑。

5 乙型肝炎與腎移植

腎移植術后移植腎的功能和長期存活率與供、受體的HBV感染和復制情況密切相關。腎移植受者需長期服用免疫抑制劑，如果存在HBV感染因素，將對移植腎的功能產生重要影響。一項隨訪10年的研究表明，移植腎的長期存活率在HBV感染的受者中比無HBV感染受者中明顯降低，HBV感染受者移植腎的丟失風險增加近4倍[51]。Chen等回顧了322例術前抗-HBc陽性/HBsAg陰性的腎移植受者，術后發現HBV活化率為4.7%[52]。另一項類似研究隨訪了631例受者，術前91.4%受者抗-HBsAg陽性；隨訪中位時間為151個月時，HBV活化率為6.7%；所有受者在未接受預防治療的情況下抗-HBs效價穩定，僅2例出現HBV活化[53]。這些研究表明，在接受免疫抑制劑治療時腎移植受者HBV活化率與受者體內抗-HBs效價呈負相關。若供體存在HBV感染，針對腎移植受者的HBV感染干預措施不同。若供體HBsAg陽性，HBsAg陽性受體需接受抗病毒(如恩替卡韋)治療。若供體HBsAg/抗-HBc陽性且受體HBsAg抗體效價>10 IU/L，則受者移植后不需接受治療；若受者HBsAg抗體效價<10 IU/L，則需HBV疫苗再次免疫、HBV免疫球蛋白中和病毒或核苷類似物抗病毒治療[54]。目前，腎移植術后HBV是否潛伏在移植腎內仍未知，尚需進一步證實。

6 結語

腎臟細胞內的HBV抗原可能改變細胞的生理和生化功能而導致腎臟功能受損。用HBV表達質粒轉染腎臟細胞(如腎小管上皮細胞和腎小球間質細胞)發現HBx調節細胞凋亡[55-60]。在84%的乙型肝炎相關腎小球腎炎患者中，HBx的反式調控區發生突變[61]。本研究團隊曾發現，表達HBsAg的HBV轉基因鼠中血清補體C3降低，而腎組織補體C3升高[37]；類似改變也在HBsAg陽性乙型肝炎患者中發現，且補體C3在腎臟沉積與腎臟損傷呈正相關[62]。因此，研究和區分腎臟細胞內HBV標記的來源非常重要，針對不同來源，采取的主要治療措施可能不同。若腎臟細胞內HBV標記來自病毒顆粒內吞或HBV感染，降低病毒載量的抗病毒治療就顯得更為重要；若標記來自HBV基因組整合，目前尚處于研發階段的靶向病毒抗原的免疫治療(如抗體治療[63-65]和嵌合抗原受體T細胞免疫治療[66-67])可能具有重要的應用前景。

乙型肝炎患者血中HBsAg濃度可高達300 μg/mL。過量的HBsAg封閉中和性抗體，除導致病毒逃逸外，還促使免疫復合物沉積于腎小球基底膜。最近多項證據表明HBsAg還干擾宿主抗病毒免疫反應[68-73]。因此，尚處于研發階段的靶向HBsAg的抗體治療或抑制HBsAg分泌并促進其在細胞內降解的化合物治療[74]有望改善慢性乙型肝炎患者的肝臟和腎臟功能。