E-選擇素肽配體及其與羥基喜樹堿的偶聯物合成與抗腫瘤活性評價

張 震，趙 龍，付 穎，馮玉蓮，尤 興，郭 娜

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

E-選擇素屬于細胞黏附分子，在炎癥等因子刺激的內皮細胞中過表達[1]．E-選擇素已經被證明在多種癌細胞與內皮細胞的黏附過程中起重要作用，并介導后續的腫瘤轉移[2]．腫瘤細胞表面的某些特定結構會識別腫瘤血管內皮細胞表面過表達的E-選擇素并使腫瘤細胞黏附于血管內皮細胞表面，這是啟動腫瘤細胞隨血液遷移的第一步，因此E-選擇素可以作為靶標，其配體[3-6]則可以發揮靶向炎癥或靶向腫瘤的作用，同時有可能阻斷腫瘤轉移．唾液酸化的路易斯x(SLex)是目前公認的E-選擇素的天然配體結構，但該寡聚四糖結構與E-選擇素的結合能力較低，而合成難度卻相當大．因此，設計合成新型的高效E-選擇素配體十分必要．

除了寡糖結構，文獻中另一類E-選擇素配體為多肽分子，如已報道的七肽IELLQAR[7]和十二肽DITWDQLWDLMK[8]作為E-選擇素的配體，與糖類配體相比具有結合力強、合成成本低、易于合成等優點．本文以結構簡單的已報道的E-選擇素肽配體IELLQAR 為出發點，通過反轉氨基酸序列、在多肽的氨基端或羧基端上載一個半胱氨酸作為連接橋、D型非天然氨基酸代替這3 種方式來設計多肽序列，并分別測試其抑制HL60 細胞與HUVEC 細胞的黏附活性，以考察不同結構對多肽活性的影響并尋找更優良的多肽分子．同時，擬將該類配體與抗腫瘤藥物偶聯，考察其應用于藥物的腫瘤靶向和抗腫瘤轉移的效果．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羥基喜樹堿，化學純，上海龍翔醫藥科技有限公司；對硝基氯甲酸苯酯，化學純，國藥化學試劑有限公司；9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護的各種所需氨基酸原料，如Fmoc-異亮氨酸、Fmoc-亮氨酸等，分析純，吉爾生化(上海)有限公司；1，2-乙二硫醇、甲基苯基硫醚、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，分析純，薩恩化學技術(上海)有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氘代氯仿，分析純，北京百靈威化學試劑有限公司；無水甲醇(MeOH)，分析純，天津市盛迪達貿易有限公司；多聚賴氨酸(MW4000)，分析純，湖北康寶泰精細化工有限公司；2-氯三苯基甲基氯樹脂，天津南開和成科技有限公司．

MALDI-Tof 型核磁共振儀，美國布魯克公司；三用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；冷凍干燥機，北京博醫康儀器有限公司；循環水式真空泵、旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司．

1.2 多肽的合成

多肽的合成采用經典的Fmoc 固相合成策略，合成路線如圖1 所示．

具體操作步驟如下：

上載第1 個氨基酸：稱取1 g(0.35 mmol)2-氯三苯基甲基氯樹脂至于25 mL 反應瓶，真空干燥3 h，加入10 mL 無水DCM，32 ℃攪拌0.5 h，抽濾，將1.4 mmol 的Fmoc-氨基酸和樹脂溶于10 mL 無水DCM 中，滴加3.15 mmol(520 μL)的DIEA，32 ℃攪拌3 h，滴加0.14 mL 甲醇繼續攪拌0.5 h，抽濾，10 mL DCM、DMF、MeOH 依次洗滌樹脂各5 min，抽濾，真空干燥．

圖1 多肽的合成路線 Fig. 1 Synthesis of peptides

順序上載剩余氨基酸：上述樹脂用10 mL 30%哌啶的DMF 溶液32 ℃攪拌0.5 h，脫除Fmoc，茚三酮法監測反應進程，待反應完成后抽濾，用 10 mL DMF、異丙醇、DMF 依次洗滌樹脂各5 min，抽濾，10 mL DMF 加入樹脂中，加入1.05 mmol 的Fmoc-氨基酸、142 mg 1-羥基苯并三唑(HOBT)、398 mg O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，滴加2.1 mmol(347 μL)的DIEA，32 ℃搖床反應2.5 h．茚三酮法監測反應過程，反應完成后抽濾，用10mL DMF、異丙醇、DMF 依次洗滌樹脂各5 min，抽干，重復以上過程，上載不同氨基酸，直至合成目標多肽序列．

裂解：配制10 mL 裂解液(苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水、三氟乙酸的體積比為 5﹕5﹕2.5﹕5﹕82.5)，將樹脂和裂解液至于反應瓶，34 ℃攪拌3 h，將反應液濾入100 mL 冷乙醚中，4 000 r/min 離心5 min，收集沉淀物，乙醚洗滌3 次，離心收集沉淀物，氬氣吹干，HPLC 檢測純度，MALDI-Tof 確定相對分子質量．

1.3 體外抗黏附實驗

多聚賴氨酸(20 μg/mL)包被黑色96 孔細胞培養板，37 ℃孵育12 h．內皮細胞HUVEC 以1×105個/孔接種于黑色96 孔板，37 ℃孵育36 h 后移去培養基．實驗組加入含有20 ng/mL TNF-α的F-12 培養基，陰性對照組加入未添加TNF-α的F-12 培養基，37 ℃孵育6 h 使其表達E-選擇素．收集對數生長期的人急性早幼粒白血病細胞HL-60(1×105個/孔)，1 000 r/min 離心 5 min；加入 5 mL PBS 清洗，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入100 μL 1640培養基吹懸，加入20 μmol/L 鈣黃綠素，避光，37 ℃孵育45 min；1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入1 mL PBS 清洗，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入1640 培養基將沉淀吹懸到所需體積．以1×107個/孔的細胞密度接種于加有HUVEC 細胞的96 孔板中立即加入一定濃度的待測物，陽性對照組只加入緩沖液，37 ℃避光孵育30 min 后加入PBS 清洗3次，去除未與HUVEC 細胞結合的HL-60 細胞．每孔加入 100 μL 透膜液，檢測熒光強度(激發波長485 nm，發射波長528 nm)．黏附抑制作用與熒光強度成反比例關系，熒光值越低，說明化合物的黏附抑制效果越強．數據用GraphPad Prism 5.0 軟件處理作圖．數據采用SPSS 統計分析軟件進行差異性分析，每個試樣測3 次，數據以“平均值±標準差”表示，采用post-hocTukey 檢驗法進行顯著性分析，*、***分別表示與空白組相比有顯著差異P＜0.05、P＜0.001，###表示對照組與空白組相比有顯著差異P＜0.001．

1.4 體外細胞毒活性測試

MTT 法檢測化合物13、14、15 和多肽配體1 對人白血病細胞K562 和人肝癌細胞HepG2 的生長抑制活性．細胞存活率按照式(1)計算[9-10]．

2 結果與分析

2.1 合成的多肽序列及結構確認

通過設計反轉序列、兩端添加用于連接其他結構的半胱氨酸、使用非天然構型的D 型氨基酸這3 種策略，共獲得了12 個多肽分子(表1)，各個肽分子經HPLC 分析，純度均達到95%以上，MALDI-Tof 質譜顯示其相對分子質量均正確．以進一步應用的多肽分子1 為例，其HPLC 及MALDI-Tof 圖譜如圖2 和圖3 所示．

表1 多肽的氨基酸序列與構型 Tab. 1 Amino acid sequence and structure of peptides

圖2 化合物1的HPLC圖譜 Fig. 2 HPLC of compoud 1

圖3 化合物1的MALDI-TOF圖譜 Fig. 3 MALDI-TOF spectrum of compound 1

2.2 多肽的體外抗黏附活性

E-選擇素多肽配體可以競爭性地抑制腫瘤細胞表面的天然配體與腫瘤血管內皮細胞表面過度表達的E-選擇素的黏附，從而抑制該黏附作用所導致的腫瘤細胞遷移．因此，在體外利用表達E-選擇素配體的腫瘤細胞HL60 和血管內皮細胞HUVEC 建立了抗黏附活性測試體系，分別測試了L 型的6 條多肽(1—6)和D 型的6 條多肽(7—12)在體外抑制HL60 細胞與HUVEC 細胞黏附作用，其中空白組為未加入TNF-α，對照組為用TNF-α 刺激但沒有加入任何待測化合物．多肽終濃度為1μmol/L，實驗(圖4)表明：L 型多肽中在氨基端增加了作為連接橋使用的半胱氨酸后，即CIELLQAR(1)，具有顯著的抗黏附效果；而該濃度下，已報道的七肽IELLQAR(2)[7]則沒有明顯作用．這也與文獻[7]報道是相符合的，因為七肽2 被報道其作用強度較弱，IC50為0.2 mmol/L. 而D 型序列多肽(圖5)中發現了更多的具有明顯抗黏附活性的多肽分子(7、8、10、11 和12)．

圖4 L 型多肽(1—6)抗黏附活性 Fig. 4 Anti-adhesion activities of L-peptides(1-6)

圖5 D 型多肽(7—12)抗黏附活性 Fig. 5 Anti-adhesion activities of D-peptides(7-12)

2.3 多肽與化療藥物HCPT偶聯物的抗腫瘤活性

由于E-選擇素特異性地在腫瘤部位血管內皮高表達，因此其配體可用作靶標分子，將藥物遞送到腫瘤部位的靶點，同時鑒于E-選擇素在腫瘤轉移中的重要作用，其配體還理論上還可阻斷或抑制腫瘤的轉移．為了探索合成的肽配體在抗腫瘤方面的應用，選擇原料價廉且活性較好的L 型多肽CIELLQAR(1)為靶標分子，將其通過3 種連接橋與抗腫瘤藥物羥基喜樹堿相連，得到了偶聯物13—15 用于評價，結構如圖6 所示．

對上述偶聯物(13—15)及多肽分子CIELLQAR (1)進行體外細胞毒活性測試，結果見表2，偶聯物13—15 均基本保持了與HCPT 相當的活性，而多肽分子本身不具有明顯的細胞毒活性，一方面說明多肽分子的安全性，另一方面也說明偶聯物在培養體系中可以釋放出原藥羥基喜樹堿從而發揮抗腫瘤作用．

圖6 肽-羥基喜樹堿偶聯物(13—15)的結構示意圖Fig. 6 Structures of peptide-HCPT conjugates(13-15)

表2 化合物13—15對腫瘤細胞抑制活性結果 Tab. 2 Inhibition activity of compounds 13-15 on tumor cells

以活性最好的化合物15 為例，其MALDI-Tof 如圖7 所示，1H NMR 數據如下．

圖7 化合物15的MALDI-Tof圖譜 Fig. 7 MALDI-Tof spectrum of compound 15

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ 8.70(s，1H)，8.23(d，J＝8.8 Hz，2H)，8.12(d，J＝7.6 Hz，1H)，8.00(d，J＝7.2 Hz，2H)，7.93(m，3H)，7.68(d，J＝6.8 Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.35 ～6.56(m，7H)，5.56(s，2H)，5.44(s，2H)，4.37 ～4.13(m，8H)，3.50 ～2.95(m，11H)，2.27 ～2.05(m，4H)，1.92 ～1.39(m，16H)，1.20(d，J＝7.2 Hz，3H)，1.08(m，1H)，0.85(m，22H)．

進一步的體外抗黏附活性表明，HCPT 本身并不具有抗黏附作用，而多肽分子偶聯了藥物羥基喜樹堿后(偶聯物13—15)在1μmol/L 濃度時仍保留了多肽分子的抗黏附活性(數據未列出)．更令人興奮的是，在更低的濃度下(0.3μmol/L)，化合物13 和14 也顯示出了明顯的抗黏附效果(圖8)，說明在發揮藥物抗腫瘤作用的濃度下，偶聯物同樣具有較好的抑制腫瘤細胞黏附的作用．

圖8 偶聯物(13—15)抗黏附活性 Fig. 8 Anti-adhesion activities of conjugates(13-15)

3 結 語

本文采用固相合成法成功制備了12 個不同序列的E-選擇素肽配體，并發現了一系列活性增強的肽分子．在L 型多肽NH2-CIELLQAR-COOH 的基礎上以不同的連接方式與HCPT 進行偶聯，以研究該類配體在抗腫瘤方面的應用．其細胞毒活性和抗黏附活性測試結果表明，這些化合物同時具有較好的黏附抑制活性和對腫瘤細胞的細胞毒性．該研究為發現高效低毒的抗腫瘤靶向藥物和抗腫瘤轉移藥物提供了新的基礎數據和研究思路．