三取代靛紅衍生物的合成及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

趙連波，張 倩，付 穎，郝 磊，薩旭仁貴，韓開(kāi)林，劉 振

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

靛紅又名吲哚二酮(isatin，見(jiàn)圖1)，是一種廣泛存在于自然界中的氮雜環(huán)類(lèi)生物堿，具有良好的生物活性．近年來(lái)研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，靛紅作為天然治療癌癥的先導(dǎo)化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，同時(shí)其對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生作用，這有效降低了抗腫瘤藥物的毒副作用．靛紅衍生物不僅具有靛紅的生物學(xué)特性，而且既傳承了傳統(tǒng)中藥的優(yōu)點(diǎn)又克服了現(xiàn)有抗癌藥物損害正常細(xì)胞的缺點(diǎn)，其中一些衍生物已經(jīng)成功用于治療癌癥．

本課題組前期研究[5-7]發(fā)現(xiàn)了靛紅1 位、5 位是關(guān)鍵活性位點(diǎn)，為了研究三取代靛紅衍生物對(duì)活性的影響，本研究以4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮為起始原料，通過(guò)NBS 溴代、鈴木偶聯(lián)反應(yīng)(Suzuki-Coupling)、N-烷基化三步反應(yīng)制備合成了3 種新型三取代靛紅衍生物，利用核磁共振方法確定了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并利用MTT 法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)了目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響．

圖1 靛紅母核結(jié)構(gòu)式 Fig. 1 Structure of isatin

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮、4-甲氧基苯硼酸等試劑，化學(xué)純，百靈威科技有限公司；N-溴代丁二酰亞胺、4-甲氧基氯化芐、[1，1′-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀、乙酸鉀、碳酸鉀等試劑，化學(xué)純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；喜樹(shù)堿(CPT)，北京偶合科技有限公司；甲醇、石油醚、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)及1，4-二氧六環(huán)等溶劑，分析純，北京化學(xué)試劑公司．

TX323L 型電子分析天平，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；循環(huán)水式真空泵，河南予華儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；低溫恒溫反應(yīng)浴，鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司；Av-400 MHz 型核磁共振儀，瑞士Bruker 公司．

1.2 合成路線

以4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮為起始原料，通過(guò)NBS 溴代、鈴木偶聯(lián)反應(yīng)、N-烷基化三步反應(yīng)制備目標(biāo)化合物，具體合成路線如圖2 所示．

1.2.1 化合物a 的合成

將4-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)、N-溴代丁二酰亞胺0.83 g(4.64 mmol)溶解于DMF(3 mL)中，室 溫反應(yīng)24 h．TLC 檢測(cè)反應(yīng)完全后，將其倒入冰水中，產(chǎn)生紅色固體．過(guò)濾收集沉淀，沉淀用甲醇重結(jié)晶，得到4，5-二溴吲哚二酮1.11 g，產(chǎn)率為83%(未經(jīng)純化直接進(jìn)行下步反應(yīng))．

圖2 1，4，5、1，5，6、1，5，7-三取代靛紅衍生物合成路線 Fig. 2 Synthesis route of 1，4，5，1，5，6，1，5，7-trisubstituted isatin derivatives

將4，5-二溴吲哚二酮0.50 g(1.64 mmol)、4-甲氧基苯硼酸 0.30 g(1.97 mmol)、PdCl2(dppf)0.06 g (0.08 mmol)、CH3COOK 0.32 g(3.28 mmol)溶解于1，4-二氧六環(huán)(5 mL)中，氬氣保護(hù)下，微波輔助135 ℃反應(yīng)30 min．TLC 檢測(cè)反應(yīng)完全后，將其倒入50 mL 水中，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取(100 mL)3 次，合并有機(jī)相．有機(jī)相用飽和NaCl 水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到固體產(chǎn)物4，5-二(4-甲氧基苯基)吲哚二酮0.27 g，產(chǎn)率為45%(未經(jīng)純化直接進(jìn)行下步反應(yīng))．

將 4，5-二(4-甲氧基苯基)吲哚二酮 0.10 g (0.28 mmol)、無(wú)水碳酸鉀0.12 g(0.84 mmol)、4-甲氧基芐氯0.05 g(0.36 mmol)室溫下溶解于DMF(2 mL)中，室溫反應(yīng)12 h．TLC 檢測(cè)反應(yīng)完全后，將其倒入冰水中，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取(50 mL)3 次，合并有機(jī)相．有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)．粗產(chǎn)品用洗脫劑洗脫(V石油醚﹕V乙酸乙酯＝10﹕1～1﹕1)，200～300 目硅膠柱層析純化．得到固體化合物a，產(chǎn)率為80%．

1.2.2 化合物b 的合成

化合物b 的合成方法同化合物a．以6-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)為起始原料，依次通過(guò)溴化、鈴木偶聯(lián)反應(yīng)和烷基化反應(yīng)獲得化合物 b，產(chǎn)率為91%．

1.2.3 化合物c 的合成

化合物c 的合成方法同化合物a．以7-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)為起始原料，依次通過(guò)溴化、鈴木偶聯(lián)反應(yīng)和烷基化反應(yīng)獲得化合物 c，產(chǎn)率為92%．

1.3 體外抗腫瘤活性測(cè)試

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人肝癌細(xì)胞HepG2 和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，用0.25%胰蛋白酶消化(貼壁細(xì)胞)，以5×104mL-1細(xì)胞密度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育一定時(shí)間(懸浮細(xì)胞孵育2 h，貼壁細(xì)胞孵育24 h)．每組設(shè)3 個(gè)平行孔，每孔加入不同濃度化合物0.5 μL．同時(shí)設(shè)置等體積DMSO 溶劑對(duì)照組和喜樹(shù)堿陽(yáng)性對(duì)照組．37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h 終止培養(yǎng)．貼壁細(xì)胞小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，每孔加入100 μL DMSO；懸浮細(xì)胞每孔繼續(xù)加入100 μL 鹽酸-異丙醇溶液后反復(fù)吹打混勻．置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱10 min， 臜甲結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀(貼壁細(xì)胞選擇492、630 nm，懸浮細(xì)胞選擇578、630 nm)測(cè)定吸光度(A)．按式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率[8]，并計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度IC50值．

1.4 化合物c對(duì)K562細(xì)胞增殖的作用

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，按5×104mL-1細(xì)胞密度接種于 96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L 的化合物c，對(duì)照孔僅加入DMSO 溶劑．將孔板置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，孵育48 h，每孔加入5 mg/mL 的MTT 20 μL 繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL 鹽酸-異丙醇溶液后反復(fù)吹打混勻．再將孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并采用GraphPad Prism 5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．

1.5 Annexin-V/PI 雙染法檢測(cè)化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，以5×104mL-1接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入0.2 μmol/L 和2 μmol/L 化合物c，24 h 和48 h 后，1 000 r/min 離心5 min．除去培養(yǎng)基上清液，用預(yù)冷的1×PBS 將細(xì)胞吹懸，2500 r/min 離心5 min，除去上清液，冰浴．加入一定量的1×Binding Buffer 到離心管中重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP 管中進(jìn)行染色，輕輕振蕩混勻，25 ℃避光孵育10 min；補(bǔ)加400 μL 1×Binding Buffer 后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試[9]．

1.6 PI染色檢測(cè)化合物c對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，以5×104mL-1細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入0.2 μmol/L 和2 μmol/L 化合物c，24 h 和48 h 后，將細(xì)胞分別收集至EP管中，2 500 r/min 離心5 min．棄去上清液，加PBS 緩沖液將細(xì)胞吹懸，2 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，重復(fù)1 次；加入1 mL 75%乙醇于4 ℃固定過(guò)夜．1 000 r/min 離心5min，棄固定液．用1 mL PBS緩沖液洗滌1次，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液．用 500 μL PBS(含有 50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% TritonX-100)4 ℃避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo 7.6 軟件分析PI熒光強(qiáng)度圖．

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物光譜數(shù)據(jù)

化合物a：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.74(s，3H)，3.79(s，6H)，4.91(s，2H)，6.69～6.71(d，2H， J＝8.4 Hz)，6.76～6.81(m，3H)，6.85～6.90(m，4H)， 6.97～6.99(d，2H，J＝8.0 Hz)，7.31～7.33(d，2H，J＝8.4 Hz)，7.43 ～7.45(d，1H，J ＝8.0 Hz).13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 43.4，55.1，55.1，55.3，109.5，113.2，113.2，113.4，113.4，114.4，114.4，115.1，126.7，126.7，129.0，129.0，130.7，130.7，131.3，131.3，131.8，137.6，139.2，141.1，150.1，158.0，158.4，159.3，159.4，182.2. ESI-MS 480.1 [M+H]+.

化合物b：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.77(s，3H)，3.79(s，3H)，3.79(s，3H)，4.89(s，2H)，6.73～6.77(m，4H)，6.81(s，1H)，6.87 ～6.97(m，6H)，7.29～7.31(d，2H，J＝8.4 Hz)，7.61(s，1H).13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 43.5，55.2，55.2，55.3，112.6，113.7，113.7，113.7，113.7，114.4，114.4，116.3，126.7，127.4，129.0，129.0，130.6，130.6，130.6，130.6，132.0，132.5，136.1，149.4，150.2，158.6，158.8，159.4，159.4，182.9. ESI-MS 480.2 [M+H]+.

化合物c：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.73(s，3H)，3.83(s，3H)，3.87(s，3H)，4.68(s，2H)，6.53～6.55(d，2H，J ＝7.8 Hz)，6.64 ～6.66(d，2H，J ＝8.4 Hz)，6.83～6.85(d，2H，J＝8.0 Hz)，6.93～6.95 (d，2 H，J＝7.8 Hz)，7.03～7.05(d，2 H，J＝8.0 Hz)，7.44～7.46(d，2H，J＝8.0 Hz)，7.47(s，1H)，7.83(s，1 H).13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ 43.5，55.2，55.2，55.3，110.3，113.4，113.4，113.6，113.6，114.4，114.4，116.7，126.4，126.8，129.1，129.1，130.3，130.3，131.6，131.6，132.0，133.6，136.9，143.8，150.1，158.7，159.0，159.4，159.4，182.8. ESI-MS 480.2 [M+H]+.

2.2 三取代吲哚二酮衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

化合物a、b 和c 在1，4，5 位、1，5，6 位和1，5，7 位引入3 個(gè)4-甲氧基苯基取代基，其生物學(xué)活性與母核靛紅相比，化合物a、b 和c 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的抑制活性顯著提升，化合物c 對(duì)HepG2 和HT-29 細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用(表1)．

表1 三取代吲哚二酮衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 Tab. 1 Effect of tri-substituted isatin derivatives on tumor cells

分析原因可能是在4，5 位和5，6 位引入相鄰兩個(gè)4-甲氧基苯基取代造成空間太擠，從而影響其生物學(xué)活性，5，7 位引入的兩個(gè)4-甲氧基苯基避免了空間擁擠的問(wèn)題，從而使活性得到提升．綜上所述，空間位阻較小的三取代靛紅衍生物體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性較靛紅母核顯著提高．綜上，1，5，7 位引 入的3 個(gè)4-甲氧基苯基的化合物c 抗腫瘤活性顯著優(yōu)于化合物a 和b．

2.2.1 化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞的抑制作用

不同濃度化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞增殖的抑制作用如圖3 所示．由圖3 可知：化合物c 能顯著抑制K562 細(xì)胞存活率，呈現(xiàn)濃度依賴性；當(dāng)化合物c 濃度為0.01、10、100 μmol/L 時(shí)，K562 細(xì)胞存活率分別為為97.06%、9.41%、2.84%．

圖3 不同濃度化合物c對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用 Fig. 3 Inhibitory effect of different concentrations of compound c on K562 cell’s proliferation

顯微鏡下觀察K562 細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4所示．正常對(duì)照DMSO 組細(xì)胞呈圓形，而加入不同濃度化合物c 的測(cè)試組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較明顯的變化，部分呈現(xiàn)不規(guī)則梭形細(xì)胞及凋亡小體，且凋亡細(xì)胞數(shù)量與化合物c 的濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)．

圖4 化合物c對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 Fig. 4 Influence of compound c on K562 cell’s morphology

2.2.2 化合物c 誘導(dǎo)K562 細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，因此采用Annexin-V/PI 雙染法檢測(cè)化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞凋亡的作用，如圖5 所示．空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為4.2%，0.2 μmol/L 化合物c 處理24 h 時(shí)，細(xì)胞凋亡率為11.3%；處理48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率增加至19.2%．2 μmol/L 化合物c 處理24 h 時(shí)，細(xì)胞凋亡率為18.1%，處理48 h 時(shí)，細(xì)胞凋亡率增加至49.4%．這說(shuō)明化合物c 能夠明顯誘導(dǎo)K562 細(xì)胞的凋亡，這有可能是它抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一．

圖5 化合物c對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響 Fig. 5 Effect of compound c on K562 cell’s apopotosis

2.2.3 化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響

前期細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果能夠明顯觀察到K562 細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)、呈棒狀的現(xiàn)象[10]，因此，研究化合物c抑制K562 細(xì)胞生長(zhǎng)是否與其細(xì)胞周期阻滯有關(guān)．化合物c 對(duì)K562 細(xì)胞周期的影響如圖6 所示．0.2、2 μmol/L 化合物c 處理K562 細(xì)胞處理3、6、12、24 h 后，G2/M 期出現(xiàn)阻滯，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性. 0.2 μmol/L 化合物c 作用K562 細(xì)胞6 h 和24 h 時(shí)，G2/M 期所占比例分別為14.20%、27.84%.2 μmol/L化合物c 作用K562 細(xì)胞6 h 和24 h 時(shí)，G2/M 期所占比例分別為25.80%、84.67%．這表明化合物c 抑制K562 細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞周期阻滯作用相關(guān)．

圖6 化合物c對(duì)K562細(xì)胞周期的影響 Fig. 6 Effect of compound c on K562 cell’s cycle

3 結(jié) 論

本文合成了3 種三取代靛紅衍生物，利用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)了目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響．MTT 測(cè)試結(jié)果表明：在1，4，5 位(化合物a)、1，5，6 位(化合物b)引入3 個(gè)4-甲氧基苯基取代基造成空間太擠，其生物學(xué)活性未有改善；1，5，7 位引入3 個(gè)4-甲氧基苯基(化合物c)避免了空間擁擠的問(wèn)題，從而使活性得到顯著提高．流式細(xì)胞儀檢測(cè)化合物c 的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，化合物c 能顯著誘導(dǎo)白血病K562 細(xì)胞的凋亡和G2/M 期阻滯，并與化合物濃度和處理時(shí)間成正相關(guān)．這表明空間位阻較小的三取代靛紅衍生物體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性較靛紅母核顯著提高，以此為該類(lèi)化合物的進(jìn)一步衍生化和構(gòu)效關(guān)系研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)．