小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的分離培養(yǎng)

劉青青

摘 要 在發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)研究領(lǐng)域，小鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞都是極為重要的細(xì)胞材料。它可用于關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)分析、線粒體功能及電生理研究，為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。本研究旨在建立一種高效穩(wěn)定的小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞 海馬神經(jīng)細(xì)胞 原代細(xì)胞培養(yǎng) C57BL/6J小鼠

中圖分類號(hào)：R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞具有不受體內(nèi)因素干擾，易于觀察和造模等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、缺血性腦血管疾病等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究。海馬神經(jīng)細(xì)胞包含了神經(jīng)細(xì)胞的大部分類型，體外培養(yǎng)過程中能形成廣泛的樹突連接。分離提取小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞不僅能達(dá)到較高的細(xì)胞純度，且神經(jīng)細(xì)胞具有較高的一致性。但是由于神經(jīng)細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，體外培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢且不能傳代，因此掌握一種高效穩(wěn)定地分離培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的方法尤為重要。本研究提供了一種分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞的方法，該方法可重復(fù)性好，獲取的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及突觸延展?fàn)顟B(tài)良好。

1材料與方法

1.1材料與儀器

小鼠腦切片模具、剃須刀片、眼用手術(shù)剪和鑷子、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、1mL和5mL無菌注射器、臺(tái)式離心機(jī)、顯微鏡、體視顯微鏡、超純水機(jī)、高壓滅菌鍋、pH計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)箱

1.2試劑

Neurobasal medium（NBM）、B27 supplement（50祝MEM/F12、FBS、PBS、100姿埂？.22 m過濾器購自Thermo Fisher Scientific;Papain、Trypsin inhibitor、poly-D-lysine（PDL）、2-Amino-5-phosphonopentanoic acid（APV）、BSA、L-Cysteine、D-glucose、Sucrose、Hepes購自Sigma公司; NaOH、NaCI、KCI、Na2HPO4、KH2PO4購自國藥化學(xué)試劑公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)的C57BL/6J雌雄鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障系統(tǒng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

2方法

2.1溶液配制

2.1.1 PDL配制及培養(yǎng)皿包被

滅菌的ddH2O溶解適量PDL，配制成0.1mg/mL的工作濃度。取1mL加入到35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置到細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。第二天吸棄未聚合的PDL，用PBS洗2次，即可接種細(xì)胞。

2.1.2解剖液

分別稱取8g的NaCI，0.4g的KCI，0.024g 的Na2HPO4，0.03g的KH2PO4，2.35g的Hepes，6g的D-glucose和15g的Sucrose，加入700mL的ddH2O溶解后，使用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，然后定容至1L，高壓滅菌后備用。

2.1.3 Papain酶消化液

分別取出50units的Papain，100 L的3mg/mL的L-Cysteine，50 L的5mM的APV，7 L的0.1mol/L的NaOH加到15mL的離心管中，用解剖液補(bǔ)足至5mL，該管記為Tube1。

2.1.4 BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液

分別稱取1g的BSA，1g的Trypsin inhibitor，加入7mL的解剖液攪拌溶解后，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，定容至10mL，0.22 m濾器除菌后備用。

2.1.5 高濃度Trypsin抑制液

吸取3mL的解剖液，0.3mL的BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液，30 L的5mM的APV放置到15mL離心管內(nèi)混合均勻，均分到2個(gè)離心管內(nèi)，分別記為Tube2和Tube3。

2.1.6低濃度Trypsin抑制液

吸取9mL的解剖液，90 L的BSA/ Trypsin inhibitor緩沖液，90 L的5mM的APV放置到15mL離心管內(nèi)混合均勻，均分到3個(gè)離心管內(nèi)，分別記為Tube4、Tube5和Tube6。

2.1.7細(xì)胞接種培養(yǎng)基

10%FBS+1%雙抗+89%DMEM/F12。

2.1.8海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基

10mL的B27（50祝┘尤氳？00mL的NBM中，混合即成。

2.2原代海馬神經(jīng)細(xì)胞制備

（1）性成熟的C57BL/6J雌雄小鼠按照2：1比例合籠配種。

（2）實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將解剖液、腦切片模具、Tube1-6置于冰上備用。

（3）取胎鼠或者出生1-3天的小鼠，用酒精棉球擦拭鼠體表面除菌。

（4）剪下小鼠頭部，去除頭部皮膚和腦部肌肉，暴露頭骨。

（5）輕輕地剪開軟頭骨，去除腦膜和血管后用彎鑷取出完整的腦組織放到含有預(yù)冷解剖液的腦切片模具上。以下操作均在冰浴條件下進(jìn)行，動(dòng)作要迅速。

（6）用剃須刀片沿著腦部冠狀軸切片，切成多片1mm寬的腦片。然后用1mL注射器針頭將腦片轉(zhuǎn)移到含有解剖液的培養(yǎng)皿中。

（7）體視顯微鏡下邊觀察邊用針頭去除腦片的其他組織，僅留海馬區(qū)。

（8）將海馬區(qū)組織轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中，加入Tube1中的Papain酶消化液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)消化30min，每10min取出用移液槍輕輕吹勻。

（9）將組織塊轉(zhuǎn)移到10mL的解剖液中，靜置1min。

（10）組織塊吸出轉(zhuǎn)移到Tube2中，靜置2-3min。

（11）按照上步操作，將組織塊依次轉(zhuǎn)移到Tube3-6中，每個(gè)Tube中均靜置2-3min。

（12）吸出組織團(tuán)加入到含有3mL的細(xì)胞接種培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打組織團(tuán)，組織團(tuán)變散直至消失。

（13）細(xì)胞接種到PDL包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

（14）細(xì)胞培養(yǎng)2d后，換液，培養(yǎng)基更換為海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基。

參考文獻(xiàn)

[1] Smith-Dijak ，A.I.&W.B.Nassrallah& LYJ.Zhang ，et al. Impairment and restoration of homeostatic plasticity in cultured cortical neurons from a mouse model of Huntington disease[J].Front Cell Neurosci， 2019（13）： 1-15.

[2] Revah，O.&O.Stoler&A.Neef ， et al. Dynamic gain analysis reveals encoding deficiencies in cortical neurons that recover from hypoxia-induced spreading depolarizations[J].J Neurosci， 2019（09）： 18-3147.

[3] Gee CE.，&I.Ohmert&J.S.Wieqert ， et al. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus[J].Cold Spring Harb Protoc， 2017，2017（02）： 126-130.

[4] BeaudoinG.M.&S.H.Lee&D.Singh ， et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex[J].Nat Protoc， 2012， 7（09）： 54-1171.

[5] Kaar ，A&S.J.Morley& M.G.Rae An efficient and cost-effective method of generating postnatal（P2-5） mouse primary hippocampal neuronal cultures[J].J Neurosci Methods， 2017（286）： 69-77.