紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及其在煙草中的功能驗證

孫亞男，林茹，潘曉陽，陳月，陶磊，郭長虹

(哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江省分子細胞與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000)

在自然界中存在許多限制植物生長的非生物脅迫因子，其中對植物生長影響較大的是土壤鹽分和低溫，嚴重時會造成植物生長緩慢及農作物減產[1-2]。植物經過長時間的進化，在細胞、分子、形態結構和生理代謝上形成了一系列復雜的脅迫應答機制，來感知并應對外界的脅迫環境[3]。脅迫環境誘導植物體內的大量相關基因表達[4]，其中多種類型的轉錄因子在植物的抗逆應答中起到重要作用。

鋅指蛋白(zinc-finger protein)是植物應對環境脅迫的一類重要調節因子[5]。鋅指蛋白根據保守基序的特點一共分為9類，分別是C2H2、C4、C6、C8、Cys3HisCys4、Cys2HisCys、Cys2HisCys5、Cys3His和Cys4HisCys3，其中以C2H2型居多[6]。研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的C2H2型鋅指轉錄因子在干旱，鹽以及ABA(脫落酸，abscisic acid)處理早期被誘導；大豆(Glycinemax)中的C2H2型鋅指蛋白基因SCOF-1可以增強轉基因植株的耐冷性[7]。說明C2H2型鋅指蛋白對于增強植物對鹽、干旱和冷脅迫的抗性具有重要作用。本實驗室之前對紫花苜蓿(Medicagosativa)的低溫轉錄組分析中發現ZAT10上調表達，然而目前關于紫花苜蓿ZAT10基因是否參與非生物脅迫應答尚未有報道。肇東苜蓿(M.sativacv. Zhaodong)為紫花苜蓿的地方性品種，具有較強的抗寒、抗鹽堿等特性[8]。本研究以肇東苜蓿為材料，克隆其MsZAT10基因，運用生物信息學方法分析其蛋白結構域特征及同源性。構建MsZAT10植物表達載體，轉化煙草(Nicotianatabacum)，在低溫及鹽脅迫條件下對轉基因煙草進行相關表型分析。為揭示MsZAT10基因的功能，通過轉基因技術提高植物抗逆境能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

MsZAT10基因從肇東苜蓿中克隆得到；用于轉化的植物材料為煙草(N.tabacumcv. SR-1)；DNA膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒均來自TIANGEN公司；反轉錄試劑盒來自TOYOBO公司；Gelmini Purification Kit(ZOMANBIO)膠回收試劑盒來自TAKARA公司。大腸桿菌Top10、根瘤農桿菌EHA105、克隆載體pMD18-T Vector和表達載體pCBM均由本實驗室提供，試驗時間為2014-2016年。

1.2 紫花苜蓿葉片RNA的提取

將紫花苜蓿的組培苗馴化移入蛭石和土混合(1∶1)的基質中，在室溫(25 ℃，16 h光照)條件下培養1個月左右，每周澆Hoagland營養液2～3次。將培養1個月的紫花苜蓿置于4 ℃條件下處理4 h，取其葉片用液氮快速冷凍，用RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取RNA，在-80 ℃中保存備用。

1.3 MsZAT10基因的克隆

以紫花苜蓿葉片RNA為模板，利用反轉錄試劑盒獲得cDNA。反應結束后，將其保存于-20 ℃。根據轉錄組測序獲得紫花苜蓿MsZAT10基因序列，應用Primer 3軟件設計克隆引物 (表1)。將上一步獲得的cDNA進行稀釋，利用ExTaqDNA polymerase (5 U·μL-1)進行PCR擴增。反應體系包含模板DNA (50 ng·μL-1) 10 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix 4 μL、ExTaq DNA polymerase 0.25 μL、正、反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，用ddH2O補足50 μL。反應條件為94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、53.5 ℃ 30 s、72 ℃ 65 s、30個循環。用1%瓊脂糖凝膠分離PCR產物，將目的片段用膠回收試劑盒回收后與pMD18-T Vector載體連接，送至上海生工公司測序。

表1 本研究中所用的引物

1.4 生物信息學分析

利用Contig Express軟件對測序結果進行拼接，通過在線ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到MsZAT10基因的開放讀碼框。利用SMART軟件對MsZAT10開放讀碼框氨基酸序列進行結構域預測，將預測的MsZAT10的氨基酸序列利用NCBI protein BLAST進行比對，同MtZAT10蛋白的結構域比較，利用Clustal X 2.1軟件找出其所相對應的結構域中氨基酸的差異位點。從NCBI獲取蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆等其他物種ZAT10同源的氨基酸序列，利用Clustal X 2.1和MEGA 4軟件進行比對并構建系統發育進化樹。

1.5 轉MsZAT10基因煙草的獲得及qRT-PCR檢測

將MsZAT10基因與pMD18-T Vector載體連接，轉化大腸桿菌，提取質粒，進行PCR和酶切檢測，篩選出正向插入的陽性克隆，用PstⅠ和SacⅠ對pMD18-T-MsZAT10和pCBM進行酶切并連接，然后進行PCR和酶切鑒定，獲得植物表達載體pCBM-MsZAT10。利用凍融法將陽性克隆轉入到農桿菌EHA105中，采用葉盤法對煙草進行遺傳轉化[9]，經過草丁膦(phosphinothricin, PPT)抗性篩選和PCR鑒定，獲得轉基因煙草植株。

將長勢相對一致，生長狀態良好的轉MsZAT10基因煙草進行qRT-PCR，選取的植株為OX1，OX2，OX3，OX5，OX15，OX21，OX22，OX23，OX24(過表達株系overexpression line 1、2、3、5、15、21、22、23和24號)。應用Primer 3軟件設計PCR定量引物，引物序列(表1，其中GAPDH為內參基因)，引物退火溫度為55 ℃左右，引物長度20 nt，GC含量40%～60%，擴增片段長度180～250 bp。使用TOYOBO公司qRT-PCR試劑盒(THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix)，每個樣品設置3次技術重復，qRT-PCR反應總體系20 μL，內含SYBR 10 μL、50×ROX 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、模板2 μL、ddH2O 6 μL。反應程序為95 ℃ 5 min、94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s。其中最后一步為擴增產物的溶解曲線分析。定量結果采用比較2-ΔΔCT法[10]計算基因表達量。

1.6 低溫處理下轉MsZAT10基因煙草表型的觀察和電導率的測定

選取大小及生長狀態一致的4周齡轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草，將其先置于4 ℃條件下處理4 h，之后再繼續降溫至-4 ℃條件下處理2 h，觀察其表型變化。參照Zhao等[11]測定相對電導率，取低溫處理后的轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草的第2～3片葉子，每片葉子用直徑約5 mm的打孔器進行打孔，將煙草葉圓片放于20 mL去離子水(大約為10個葉圓片)，通過真空泵抽真空15 min，靜置20 min后，利用電導儀測得S1。再煮沸20 min，涼置室溫，測得S2，S1/S2×100%即為電導率。每個處理設置3次重復。

1.7 轉MsZAT10基因煙草的鹽脅迫處理方法

選取大小及生長狀態一致的4周齡轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草用直徑9 mm的打孔器在葉片的相同部位打孔(打孔時盡量避免葉脈部分)，將取得的葉圓片浸泡在含有300 mmol·L-1NaCl的1/2MS溶液中，觀察葉片變化。采用80%丙酮抽提比色法測定葉片中葉綠素含量[12]。

1.8 生理指標測定

選取大小及生長狀態一致的4周齡轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草，將低溫處理組置于0 ℃，對照組置于25 ℃培養5 h后，取煙草第2～3片葉子，每份0.1 g稱好后采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)比色法測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[12]、采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[13]、采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[13]。所有指標測定均設置3次重復。

1.9 數據分析

所有試驗均設置3次重復，所用數據為3次重復的平均值。用生物統計學軟件SPSS 13.0對數據進行顯著性分析，數據用平均值±標準誤差(mean±SE)表示。兩組以上采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行檢驗分析，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。兩組之間采用t檢驗，*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及蛋白結構域分析

提取紫花苜?？俁NA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，根據轉錄組測序結果設計MsZAT10的上下游克隆引物，利用RT-PCR技術擴增MsZAT10，將其克隆到pMD18-T Vector。經測序該基因全長762 bp，編碼253個氨基酸。利用軟件SMART對MsZAT10開放讀碼框氨基酸序列進行結構域預測，發現MsZAT10含有2個單C2H2型的保守結構域(圖1)，有典型的QALGGH保守基序，屬于C2H2型鋅指蛋白。

圖1 MsZAT10的蛋白結構域

圖2 物種間的ZAT10構建的系統發育進化樹

2.2 MsZAT10氨基酸序列同源性分析

將紫花苜蓿MsZAT10氨基酸序列與蒺藜苜蓿、大豆等10種不同物種的ZAT10氨基酸序列進行比對，利用MEGA 4制作系統進化樹，得知MsZAT10與大豆、花生(Arachishypogaea)等物種中ZAT10氨基酸序列的親緣關系較近，與蒺藜苜蓿序列的親緣關系最近(圖2)。通過NCBI protein BLAST對MsZAT10的氨基酸序列進行分析，與蒺藜苜蓿的氨基酸相似性為76%。MsZAT10的氨基酸序列與MtZAT10的保守結構域相同，非保守結構域氨基酸序列差異很大。MsZAT10的氨基酸序列與MtZAT10的氨基酸序列相比有30個缺失、31個替換以及32個插入(圖3)。

圖3 MsZAT10和MtZAT10氨基酸的比對

2.3 植物表達載體pCBM-MsZAT10的構建與轉MsZAT10基因煙草的qRT-PCR檢測

用PstⅠ和SacⅠ對pMD18-T-MsZAT10和pCBM進行酶切并連接，然后進行PCR和酶切鑒定，獲得植物表達載體pCBM-MsZAT10(圖4)。通過農桿菌介導法對煙草進行遺傳轉化，獲得PCR陽性植株25株。通過qRT-PCR(表1)分析轉基因煙草中MsZAT10的表達量(圖5)，結果顯示，MsZAT10在轉基因煙草中均有表達，其中有3個株系的MsZAT10基因表達量較高，分別是OX3、OX15和OX23，因此后續研究以這3個轉基因株系為材料。

圖4 植物pCBM-MsZAT10過表達載體的構建

2.4 轉MsZAT10基因煙草低溫脅迫表型及電導率分析

圖5 過表達MsZAT10幼苗中的MsZAT10表達水平

選取大小及生長狀態一致的4周齡轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草置于4 ℃處理4 h后，再置于-4 ℃處理2 h，觀察表型變化，可以看到轉MsZAT10基因煙草葉片的萎蔫程度明顯低于野生型煙草(圖6A)。測煙草葉片的電導率發現轉MsZAT10基因煙草葉片的電導率比野生型煙草低。其中OX23的電導率較野生型煙草相比下降了21.47%，其次是OX3下降了18.07%，最后是OX15下降了15.31%。說明轉MsZAT10基因煙草的細胞質膜受損傷程度較野生型煙草輕(圖6B)，說明轉MsZAT10基因煙草具有較強的抗寒能力。

2.5 低溫脅迫下轉基因煙草生理指標的測定

選取大小及生長狀態一致的4周齡轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草經0 ℃處理5 h，取葉片測定其生理指標(圖 7)。低溫處理后，3個轉MsZAT10基因煙草的脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著高于野生型煙草，其中OX3較野生型相比升高55%和52%，OX15升高48%和42%，OX23升高62%和57%。而3個轉MsZAT10基因煙草的MDA含量明顯低于野生型煙草，其中OX3較野生型相比下降38%、OX15下降31%、OX23下降35%。以上結果表明轉MsZAT10基因煙草具有較強的抗寒能力。

圖6 低溫處理后WT和轉MsZAT10基因煙草的表型和電導率

圖7 低溫脅迫下WT和轉MsZAT10基因煙草的生理指標

圖8 在300 mmol·L-1 NaCl處理下，WT和轉MsZAT10基因煙草的表型和葉綠素含量

2.6 轉MsZAT10基因煙草耐鹽性分析

取葉圓片，在300 mmol·L-1NaCl中處理(圖 8A)，隨著時間的增長轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草的葉圓片均受到不同程度的鹽脅迫損傷。處理4 d后觀察到野生型煙草葉圓片白化，而轉MsZAT10基因煙草葉圓片保持綠色。對照組中轉MsZAT10基因煙草和野生型煙草的葉綠素含量差異不顯著，但在處理組中轉MsZAT10基因煙草的葉綠素含量顯著高于野生型煙草，其中最高的是OX15，比野生型高82%；其次是OX23，比野生型高81%；最后是OX3，比野生型高62%(圖 8B)。以上結果表明，轉MsZAT10基因煙草具有較強的抗鹽能力。

3 討論與結論

C2H2型鋅指蛋白家族是植物中轉錄因子數目居多的龐大家族，功能也較復雜。研究表明，C2H2型鋅指蛋白廣泛參與植物生長和發育等生物過程，包括表皮形成，種子發芽，花器官發育，主要的microRNA生物合成等[14]。一些C2H2型鋅指蛋白也參與了非生物脅迫應答。近年來克隆獲得了許多與非生物脅迫相關的植物鋅指蛋白基因，這些基因在應對外界不利的環境中發揮了重要的作用。Zhang等[15]從番茄(Lycopersiconesculentum)克隆到C2H2型基因SlCZFP1，該基因受低溫、干旱、鹽脅迫誘導，過表達SlCZFP1可顯著提高轉基因擬南芥的低溫抗性。擬南芥ZAT18基因受干旱脅迫誘導，過表達ZAT18基因的擬南芥植株表現出較強的干旱抗性，而該基因的突變體則降低了對干旱脅迫的抗性[16]。番茄的SIZF3基因被鹽誘導，轉SIZF3基因的番茄和擬南芥表現出較強的抗鹽性[17]。小麥(Triticumaestivum)的一個新型C2H2型鋅指蛋白TaZNF的編碼基因受鹽脅迫誘導。轉TaZNF擬南芥植株，會極大地增強耐鹽能力[11]。在紫花苜蓿低溫脅迫轉錄組測序工作中，發現MsZAT10基因明顯上調表達，暗示該基因可能在紫花苜蓿抵抗低溫脅迫過程中發揮重要作用。ZAT10屬于雙鋅指結構域類的鋅指蛋白，有研究表明ZAT10參與植物不依賴ABA的低溫信號轉導途徑，還受到上游ZAT12與CBFs信號通路的調控，同時下游的低溫相關基因COR被其調控[18]。此外還有研究表明，MAPK激酶磷酸化途徑可能直接調節轉錄因子ZAT10[19-20]。本研究克隆獲得的MsZAT10基因具有2個鋅指蛋白結構域(圖1)，有典型的QALGGH保守基序(圖3)，屬于C2H2型鋅指蛋白。紫花苜蓿MsZAT10與蒺藜苜蓿MtZAT10的氨基酸有76%的同源性，有93個氨基酸差異位點，其中有31個替換、30個缺失以及32個插入(圖3)。肇東苜蓿為多年生牧草，具有較強的抗寒、抗鹽堿等抗逆能力，這些氨基酸差異可能是MsZAT10在肇東苜?？鼓嫘灾衅鹱饔玫年P鍵位點。

為了研究MsZAT10在抗逆方面的功能，本研究通過農桿菌介導法獲得過表達MsZAT10的煙草。在低溫和鹽脅迫下，轉MsZAT10基因煙草表現出較強的抗性表型。同時，在低溫脅迫下，轉MsZAT10基因煙草的脯氨酸和可溶性蛋白含量都高于野生型煙草，而MDA含量低于野生型煙草。在逆境脅迫下，植物體內會積累大量的滲透調節物質，這些物質的含量變化可以作為評價植物耐受性的指標之一。其中最常見的滲透調節物質是脯氨酸和可溶性蛋白，其積累量與植物的抗逆性呈正相關[21]。比如，轉枳(Poncirustrifoliata)PtrZPT2-1基因的煙草，在低溫和鹽脅迫下積累了更多的游離脯氨酸[22]，轉OsMSR15基因的擬南芥，在干旱脅迫下，積累了更多的游離脯氨酸[23]。脯氨酸含有亞氨基，可以與蛋白質的疏水結構域結合，積累更多的可溶性蛋白，進而維持低溫脅迫時酶的構象[24]。研究發現低溫脅迫后轉HuCAT基因煙草的可溶性糖含量的增加幅度大于野生型煙草,由此可見，轉HuCAT基因煙草有更強的耐寒性[25]。崔旭昕[26]研究表明，在低溫處理條件下，轉OsC2H2-12基因水稻(Oryzasativa)跟野生型相比積累了更高含量的可溶性蛋白和可溶性糖、更高的過氧化物酶活性，并且轉OsC2H2-12基因水稻的葉綠素降解速度較野生型更慢一些，由此證明OsC2H2-12基因可以增強水稻的耐冷性。Xu等[27]研究表明，在低溫處理下，轉EjDHN1基因材料與對照組相比，轉EjDHN1基因株系的植物生長明顯優于野生型。EjDHN1可以保護細胞免受冷脅迫下活性氧產生的氧化損傷。EjDHN1過表達導致的耐寒性增強可部分歸因于它們通過減輕氧化應激對膜的保護作用。Wang等[28]研究的轉SlNAC35基因植株在低溫脅迫下表現出高葉綠素含量、低活性氧物質積累和膜損傷。SlNAC35過表達增強了轉基因番茄的耐寒性。本研究中，在低溫脅迫下，轉MsZAT10基因煙草與野生型煙草相比積累了更多的脯氨酸和可溶性蛋白，推測轉MsZAT10基因煙草增強了耐冷性，可能是通過積累更多的滲透調節物質，減少脅迫帶來的損傷，使植物細胞維持正常的生命活動。植物在受到低溫脅迫時，細胞內會產生ROS，而ROS的產生和積累會導致膜脂發生過氧化作用，最后造成植物細胞的損傷[29]。MDA是膜脂過氧化產物，其含量的變化是衡量質膜受損程度的重要標志之一[30]。大豆GsZFP1基因在擬南芥植株中過量表達，提高了轉基因植株的耐冷性，降低了轉基因植株在低溫脅迫下的MDA含量[31]。本研究中，在低溫脅迫下，轉MsZAT10基因煙草MDA含量明顯低于野生型煙草，這說明過表達MsZAT10基因能夠降低植物膜脂過氧化程度和膜系統的損傷，增強了轉MsZAT10基因煙草對低溫脅迫的耐受性。因此MsZAT10基因可以提高煙草對低溫及鹽脅迫的耐受性，本研究結果豐富了植物逆境脅迫抗性基因資源，并在植物抗逆分子育種中具有重要價值，為今后改良植物抗逆性奠定了基礎。