miR-124在腎癌中的表達以及對腎癌786-O細胞生物學行為的影響

胡剛強 費安華△ 李浩勇 寧金卓

(1.湖北省鄂州市中心醫院(武漢大學人民醫院鄂州醫院)泌尿外科，湖北 鄂州 436000；2.武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北 武漢 433000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)又稱腎癌，是一種起源于腎小管上皮系統的惡性腫瘤，其發病率和死亡率位居泌尿系統腫瘤的第三位[1-2]。清楚腎癌發生發展的機制以及確定其治療靶點，對于腎癌的診斷和治療至關重要[3-4]。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的小RNA 分子，可在轉錄后水平結合基因的3’非翻譯區(3’untranslatedregion，3’UTR)調控靶基因表達，從而發揮其生物學作用[5]。miR-124是近年來發現的miRNAs家族中的一個重要分子，miR-124可通過多種信號轉導途徑調控腫瘤的發生發展過程。本實驗旨在研究miR-124在腎癌組織的表達以及過表達miR-124后對腎癌786-O細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并進一步探討miR-124是否通過調控Zeste同源增強子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)來實現其作用。

1 材料與方法

1.1試劑及材料 人腎癌786-O細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養基和胎牛血清，美國Gibco公司；Trizol、Lipofectamine2000試劑、MTT檢測試劑盒，美國Invitrogen公司；miR-214 mimics及對照(miR-214 NC)由上海吉瑪生物技術公司提供；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒，Takara 生物有限公司；Transwll 小室、Matrigel基質膠，美國Corning公司；EZH2抗體，Abcam公司。

1.2病例標本 收集62例2016年1月至2018年6月在我院手術的患者腎癌病理組織標本及相應癌旁正常組織標本，其中男27例，女35例，年齡43～76歲，平均59.3歲。術中組織液氮凍存后放入-80 ℃液氮中存用。本研究中的所有方案均獲得了醫院倫理委員會同意并獲得批準，術前患者均簽署了知情同意書。

1.3細胞培養及轉染 腎癌 786-O 細胞在37℃、5% CO2的DMEM培養基中培養，0.25%的胰酶消化傳代。2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。細胞接種于6孔板中，待細胞融合至70%～80%，腎癌細胞采用無血清的培養基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000說明書操作進行轉染及后續的實驗分析。

1.4細胞增殖水平檢測 采用MTT比色法，將成功轉染miR-124的腎癌786-O細胞在培養箱中培養24 h后接種于96孔板中，每孔加入5 g/L二苯基溴化四氮唑藍(MTT)50 μL。孵育后加入DMSO振蕩10 min，采用自動酶標儀490 nm讀取光密度值(OD)。

1.5Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲能力 細胞遷移和侵襲實驗均使用Corning BioCoatTMMatrigel小室，分為帶膠和不帶膠小室兩種。取對數生長期的miR-124 mimics和miR-124 NC細胞，胰酶消化后加入50 μL含 10 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，調整細胞密度至2×106個/mL，將Transwell小室置入每孔500 μL 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基的24孔培養板，培養約24 h后觀察膜及孔下細胞數。將小室放入1%結晶紫溶液中染色5 min，染色結束后洗脫殘余結晶紫溶液，用棉簽擦去基質膠和小室內的細胞并拍照計數。

1.6Western blot實驗檢測EZH2蛋白表達 提取各組細胞蛋白，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后置于冰上(4 ℃)裂解30 min，采用BCA 試劑盒進行蛋白定量。PVDF膜轉膜后用含5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入EZH2抗體，放置于4 ℃孵育過夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST液洗滌3次，10 min/次，在暗室中滴加 ECL發光液曝光顯影。

1.7逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-124的表達水平 采用Trizol法提取組織中總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。以cDNA 為模板，用SYBR Green做熒光染料，RT-PCR法檢測miR-124的表達。相應引物序列miR-124 F：5’-ACTCGGCTCGTGGCACTCC-3’，R：5’-ATACCGCGGATTTGGACGCC-3’；U6 為F：5’-TATCCGTCGGCAGCCTAGGGACG-3’，R：5’-ATGCGCAACGTAATGGCTGGCA-3’。目的基因的表達采用相對定量法，即以U6 RNA作為內參，結果數據采用2-△△Ct法分析。

1.8熒光素酶報告實驗 利用生物信息預測網站預測miR-124和EZH2的結合片段。將擴增的EZH2 mRNA 的3’端非翻譯區(3’UTR)插入到pMIR-reporterTM 的miRNA 表達載體(Applied Biosystems)中，將上述熒光素酶報告載體及突變載體miR-124 NC及miR-124 mimics共同轉染至786-O細胞。培養48 h后，采用熒光素酶檢測試劑盒測定細胞的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-124在腎癌組織及癌旁正常組織中表達 62例腎癌及癌旁正常組織標本中，與癌旁正常組織相比，腎癌組織中miR-124 mRNA表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 腎癌與癌旁正常組織中miR-124的表達

2.2腎癌組織中miR-124的表達水平與腎癌患者臨床病理特征的相關性 根據miR-124在腎癌組織標本中的平均表達量，將入選患者分為miR-124高表達組(28例)和低表達組(34例)。采用χ2檢驗分析miR-124的表達水平與臨床病理特征的相關性，結果顯示，miR-124的表達與腫瘤的組織學分級、臨床分期以及淋巴結轉移密切相關，而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數目無統計學相關性。見表1。

表1 miR-124表達水平與腎癌患者臨床病理特征的相關性(n)

2.3過表達miR-124對腎癌786-O細胞增殖、遷移以及侵襲水平的影響 結果顯示，與miR-124 NC相比，miR-124 mimics組786-O細胞中增殖、遷移以及侵襲水平明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖2過表達miR-124 對786-O細胞增殖、遷移以及侵襲水平的影響

2.4miR-124 與EZH2 mRNA 3’非編碼區的互補配對序列 采用靶基因網站對miR-124的靶基因進行預測。結果顯示，miR-124與EZH2基因mRNA 3’非編碼區之間存在互補配對。熒光素酶報告結果進一步顯示，與miR-124 NC相比，miR-124共轉染的786-O細胞中，EZH2-WT表達水平明顯降低，而EZH2-MUT相對熒光素酶活性無明顯變化，表明miR-124是通過結合EZH2基因的3'UTR調節蛋白的表達。見圖3。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖3miR-124與EZH2 mRNA 3’非編碼區的互補配對序列

2.5過表達miR-124對EZH2蛋白表達水平的影響 采用Western blot實驗檢測過表達miR-124 對腎癌786-O細胞中EZH2蛋白表達的影響。結果顯示，與miR-124 NC比較，miR-124 mimics組明顯降低了EZH2的表達水平，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：與miR-124 NC比較，*P<0.05。

圖4過表達miR-124對786-O細胞中EZH2蛋白水平的影響

3 討 論

腎癌的病理過程較為復雜，其相關的多種危險因素包括吸煙、飲酒、高血壓、肥胖以及環境因素等，是一個多階段及多途徑改變的發展過程[6]。盡管外科手術是治療局限性腎癌的首選方法，但大多數腎癌患者初期癥狀通常較為隱蔽且沒有典型的癥狀，高達1/3的腎癌患者在診斷時已經轉移，而近40%的局部病變患者在手術治療后復發[7-8]。研究[9]顯示miR-124在多種器官的腫瘤組織中異常表達，參與腫瘤的發生發展過程。L.P.Wu等[10]在研究中發現，miR-124在肝癌組織中表達與腫瘤的分級分期呈負相關，通過靶向KLF4抑制肝癌進展并有望成為一種新的診斷標志物；Y.Zhao等[11]研究顯示miR-124在頭頸部鱗狀細胞癌中表達明顯低于癌旁組織，并呈外源性表達。miR-124可直接調控細胞中SphK1活性，導致增殖水平減少，集落形成延遲，腫瘤生長減慢；F.Tian等[12]研究表明miR-124通過靶向GATA6基因的表達，使膽管癌細胞的轉移和侵襲能力下降。本研究中，我們首先分析檢測腎癌組織及癌旁組織中miR-124的表達水平，發現腎癌患者組織中miR-124表達明顯低于癌旁正常組織。接下來，我們分析了腎癌組織中miR-124的表達水平與患者臨床病理特征的相關性，結果提示低表達水平的miR-124與腫瘤的高組織學分級、高臨床分期以及淋巴結轉移陽性密切相關，而與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數目等均無關。此外，在786-O細胞中過表達miR-124后，細胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，提示miR-124可能與腎癌的發生及發展有關，在腎癌中可能扮演了“抑癌基因”的角色。

EZH2基因也稱ENX-1，編碼在人體染色體7q35上，是多梳蛋白抑制復合體2(PcG，polycomb group)基因家族重要成員之一。其通過催化組蛋白H327位點的三甲基化(H3K27me3)，對相關靶基因發揮轉錄抑制的作用[13-14]。L.Liu等[15]研究發現EZH2在腎癌中促進了細胞的遷移和侵襲，是晚期腎癌的潛在的治療靶點；另有文獻報道EZH2參與了乳腺癌的進展且高表達的EZH2與患者生存不良明顯相關，表明EZH2可作為乳腺癌患者的預后生物標志物和靶點[16]。S.Liu等[17]研究顯示EZH2在食管癌S100A4細胞中具有促進遷移和增殖的作用，提示ECH2在食管癌中扮演了“促癌基因”的角色。為進一步探討miR-124抑制腫瘤發生的機制，本研究通過腎癌786-O細胞實驗探討了miR-124和EZH2的關系，結果發現過表達miR-124后，EZH2蛋白表達下調，提示miR-124可能通過靶向EZH2的表達起到抑制腫瘤的作用。

綜上所述，miR-124的異常表達可能與腎癌的發生及發展密切相關，可能是靶向調控EZH2的表達以影響腎癌786-O細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究可進一步了解miR-124在調節腎癌進展中的功能和分子機制，可對腎癌的臨床診斷和治療提供新的認識。