鋅指蛋白ZNF139抑制骨肉瘤細胞增殖和轉移的機制研究

謝易 李彬彬 龔泰芳

(湖北醫藥學院附屬太和醫院骨科，湖北 十堰 442000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)的特征是惡性細胞直接形成未成熟的骨或類骨組織，被認為起源于間充質干細胞，常見于兒童和成人[1]。根據美國國家癌癥研究所的最新估計，在所有新癌癥病例中，OS占0.2%(3260)，在2018年，OS占癌癥死亡的0.3%(1550)[2]。磁共振、新輔助化療、外科手術等是OS診斷和治療的主要方法，但由于侵襲性和遠處轉移(主要是肺轉移)，總生存率仍然很低，治療OS需要新的有效可靠的方法和靶點。因此，闡明骨肉瘤的分子機制對于開發新的治療策略以改善患者的預后至關重要。尋找早期診斷和評估骨肉瘤預后的分子靶點具有重要意義。ZNF139基因是目前發現的腫瘤抑癌基因，在胃癌的侵襲轉移、腫瘤耐藥性等機制中發揮著重要的作用[3-6]，但在骨肉瘤中的研究尚不清楚。本研究通過驗證ZNF139在人骨肉瘤組織和細胞系中的表達，以及ZNF139基因對人骨肉瘤細胞增殖和轉移的作用及機制，以期揭示其對骨肉瘤發生發展的相關分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 細胞：骨肉瘤細胞系(143B、MG-63、U2OS和HOS)以及正常人成骨細胞hFOB1.19 購自上海生科所生物細胞庫；試劑：1640 培養液和胎牛血清購自美國 Gibico 公司、CCK-8 試劑購自日本同仁化學公司、酶聯蛋白V(AnnexinV)/碘化丙啶(PI)染色試劑盒購自上海碧云天公司、六孔板、96孔板購自上海威奧生物科技有限公司、實驗用一抗購自美國 CST 公司、實驗用二抗購自美國 CST 公司、PVDF膜購自美國 Millipore 公司、Cocktail 試劑購自美國羅氏試劑公司。

1.2儀器和臨床組織樣本 實驗中所用的儀器(細胞培養孵育箱、RNA濃度測量儀器Landdrop、qPCR儀、酶標儀等)均由湖北醫藥學院中心實驗室提供和使用。Tranwsell小室和基質膠(美國Millipo)。ZNF139 基因引物由天津金唯智有限公司設計并合成；收集我科2010年1月至2017年1月治療的29例骨肉瘤患者的腫瘤樣本，以鄰近正常組織樣本和病理資料。本研究得到了我院的倫理委員會的批準，組織標本診斷由我院病理科高年資醫師診斷。

1.3實驗方法

1.3.1細胞和組織RNA和蛋白提取 骨肉瘤細胞和成骨細胞的RNA和蛋白以及上述臨床樣本中RNA和蛋白提取步驟同已有的文獻報道[7]。提取后RNA在Landdrop儀器中測得濃度，通過RNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，實驗方法及步驟參考樣品實驗說明書及已有的參考文獻[13]。將逆轉錄后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2qRT-PCR檢測ZNF139在骨肉瘤中的表達 qRT-PCR 的步驟同試劑盒使用說明書和文獻所述[15]。ZNF139-F：5’-GACTGGAAGAAGCTGCTGCTAA-3’，ZNF139-R：5’-CTGACGTCTCCACAGCACTCACT-3’。使用 HT7500 生物系統以及 SYBR?Green的試劑盒。通過實時監測 PCR 擴增，選擇β-actin為內參基因，每個樣品做三個重復；用2-△△Ct法對樣本基因進行表達差異相對定量分析，在擴增的指數期對起始模板進行定量，擴增指數越高，相對表達越高。

1.3.3qRT-PCR檢測ZNF139在骨肉瘤中的表達 ZNF139過表達質粒載體購買于天津金唯智生物科技有限公司。質粒轉染方法和步驟同參考文獻[8]，活性狀態下的骨肉瘤細胞143B種于在六孔板中，轉染載體：Lipofectamine-2000(美國通用應力公司)，細胞轉染48h后收集實驗組和對照組細胞進行相應的功能實驗。

1.3.4CCK-8法和克隆形成實驗檢測ZNF139基因過表達對腫瘤細胞增殖活性的影響 CCK-8法：上述質粒轉染143B細胞48 h后取實驗組和對照組細胞計數，3 000 細胞/100 μL 1 640 培養液細胞加入96孔板中放于細胞孵育箱中繼續培養約24 h；待細胞完全貼壁后，每孔加入20 μL的CCK8試劑繼續培養2～3 h，使用酶標儀(480 nm)測定實驗組和對照組的吸光度，然后統計作圖。克隆形成實驗：細胞轉染 48 h后，實驗組與對照組計數，取1 000個細胞/100 μL 1 640培養液的細胞加入六孔板中，將六孔板放于37 ℃，5% CO2的孵育箱中繼續培養二周，當細胞形成集落克隆團后，多聚甲醛固定、染色并計數，然后統計作圖。

1.3.5流式細胞周期和凋亡實驗 流式細胞周期的方法同參考文獻[9]。質粒轉染143B細胞48 h后取實驗組和對照組細胞計數，收集并使用多聚甲醛4 ℃進行固定約24 h，避光下使用PI染色，并送流式細胞儀進行分析和統計作圖。細胞凋亡：細胞轉染48 h后收集細胞，Binding 緩沖液重懸，分別加入V-fluorescein 和碘化丙錠(PI)混勻，避光30 min，送流式細胞儀分析，統計作圖。

1.3.6Transwell實驗檢測遷移和侵襲的影響 Transwell 遷移實驗：收集上述實驗組和對照組骨肉瘤143B細胞，消化離心后并重懸；倒置顯微鏡下計數，取4×103個細胞/孔種于 transell小室上室，下室加入10% 1 640培養液約700 μL，放入細胞孵育箱中繼續培養；待24 h后取出小室，固定，染色，計數(顯微鏡下隨機5個視野)；計數并評價細胞遷移能力。Transwell 侵襲實驗：實驗前在transwell小室上室中加入基質膠(無血清1 640培養液：基質膠=1∶5)混勻，基質膠小室放入細胞孵育箱中約2～4 h，待基質膠凝固后進行侵襲實驗; 侵襲實驗步驟基本同細胞遷移實驗。所有實驗均重復3次。

1.3.7免疫蛋白印跡實驗 蛋白質印跡法檢測143B在細胞系中的相對表達：收集實驗組和對照組，提取細胞蛋白后測定蛋白濃度[10]。取50 μg/孔細胞蛋白進行凝膠電泳，常溫下將電泳分離后的蛋白轉膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，加入一抗及內參GAPDH(美國Abcam公司)，4 ℃凍庫封閉過夜。24 h后常溫下復溫約30 min，TBST液洗膜后，二抗封閉液室溫下搖床孵育2 h，顯色劑(DAB)顯色、成像儀曝光，并用 Quantity One 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH之比來表示相對表達差異。

2 結 果

2.1ZNF139 在骨肉瘤細胞系和組織中的表達 半定量PCR實驗發現，與正常成骨細胞相比，ZNF139 mRNA蛋白在骨肉瘤細胞系143B、MG-63、U2OS和HOS中低表達，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖1A；同時qRT-PCR實驗顯示，在配對的腫瘤組織中，與癌旁組織相比，ZNF139 mRNA的水平在骨肉瘤中表達下調，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖1B。免疫蛋白印跡實驗發現：與正常成骨組織比，ZNF139 蛋白在骨肉瘤組織中表達下調(P<0.001)，見圖1C。

注：(A)ZNF139 mRNA在骨肉瘤細胞系中低表達，***P<0.001;(B)ZNF139 mRNA在骨肉瘤組織中低表達，***P<0.001;(C)ZNF139 蛋白在骨肉瘤組織中表達下調，P<0.001。

圖1ZNF139在骨肉瘤細胞系和組織中的表達

2.2過表達 ZNF139 基因對抑制腫瘤細胞增殖的影響 為驗證ZNF139是否為功能性抑癌基因參與骨肉瘤進展，我們對骨肉瘤143B進行ZNF139的過表達，免疫蛋白印跡實驗驗證了ZNF139的過表達(圖2A)。CCK-8實驗發現，實驗組143B細胞轉染ZNF139后，24h、48h和72h后細胞存活率顯著下降(P<0.01)，見圖2B；克隆形成實驗發現，實驗組143B細胞克隆形成的效率(31.23%±4.18%)下降(P<0.001)，見圖2C。

注：(A)免疫蛋白印跡實驗驗證ZNF139在143B中的過表達；(B)CCK-8實驗ZNF139抑制細胞活性，P<0.01；(C)平板克隆顯示ZNF139 在抑制細胞克隆的形成，***P<0.001。

圖2ZNF139過表達對抑制骨肉瘤細胞143B增殖的影響

2.3恢復表達ZNF139基因對細胞周期及凋亡的影響 流式細胞實驗發現：骨肉瘤細胞143B過表達ZNF139后，細胞出現G0/G1期阻滯；與對照組(28.18%±3.12%)相比，實驗組中G1期細胞百分比明顯增加(45.68%±4.92%)，差異具有統計學意義(P<0.001)，見圖3A；同時凋亡實驗發現，骨肉瘤細胞143B過表達ZNF139后，細胞明顯發生凋亡，凋亡細胞增加(14.29%±5.14%)，差異具有統計學意義(P<0.001)，見圖3B。

注：(A)ZNF139過表達后使143B細胞阻滯于G1期，***P<0.001；(B) ZNF139過表達后促進143B細胞凋亡，***P<0.001。

圖3過表達ZNF139對細胞周期阻滯和促進凋亡的影響

2.4過表達ZNF139 基因對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響 Transwell細胞遷移和侵襲實驗分別檢測穩定過表達 ZNF139 以及轉染 pcDNA3.1(+)的143B細胞的遷移能力；結果發現：穩定轉染了pcDNA3.1(+)-ZNF139 實驗組穿過小室細胞數顯著低于對照組 pcDNA3.1(+)-Vector 組，差異具有統計學意義(P<0.001)，見圖4。

注：與對照組比較，***P<0.001。

圖4ZNF139過表達對骨肉瘤143B細胞遷移和侵襲的影響

2.5過表達ZNF139對p53信號通路的影響 通過蛋白質印跡檢測過表達ZNF139后對p53及下游靶基因的影響，結果顯示：過表達ZNF139后，p53激活上調及下游周期相關靶基因p21和p27的表達上調(P<0.001)，見圖5A、5B；同時凋亡相關蛋白BAX和Claeaved-Casp3表達上調(P<0.001)，見圖5A、5B。

注：(A)Western blotting 分析過表達ZNF139對p53信號通路的影響；(B)蛋白灰度分析ZNF139對p53信號通路相關靶點的影響，兩組比較，***P<0.001。

圖5ZNF139 過表達后對p53信號通路的影響

3 討 論

骨肉瘤是原發性骨惡性腫瘤死亡的主要原因，主要發生在青少年和兒童。根據癌癥統計，骨和關節惡性腫瘤占青少年和兒童癌癥死亡總數的8.9%[15]。文獻報告中：骨肉瘤手術切除患者的長期生存率僅為20%[16]。目前，以順鉑為基礎的聯合化療大大改善了骨肉瘤患者的預后，5年無轉移總生存率為60～70%[17]。然而，化療耐藥性仍是困擾骨肉瘤臨床治療的主要問題。近幾十年來，越來越多的研究開始致力于骨肉瘤的靶向治療；希望通過尋找到有效的治療靶點用于骨肉瘤的早期診斷與治療。鋅指蛋白(ZFPs)是脊椎動物基因組家族中最大的轉錄因子；大約三分之一的ZFP包含了與Krüppel相關的KRAB結構，超過一半ZFPS聚集在染色體19q13區域。ZFPs在調節細胞增殖、凋亡、分化和腫瘤發生中起重要作用。而ZFPs在骨肉瘤中作用的報道非常少見。ZNF139的cDNA為6.4 kb，編碼360個氨基酸；這種蛋白質在從大鼠到人的不同脊椎動物物種的進化過程中高度保守；已有文獻報道其在組織器官發育，腫瘤形成中起著重要的作用，但在骨肉瘤中的作用尚不清楚。

本研究中我們首先檢測了ZNF139 在骨肉瘤細胞系和組織中的相對表達情況。研究發現，與成骨細胞相比，ZNF139 mRNA在骨肉瘤細胞系中表達下調；在配對的臨床樣本組織中，ZNF139 mRNA和蛋白在骨肉瘤組織中表達明顯下調，其可能作為潛在的抑癌基因參與骨肉瘤的進展。本研究結果顯示，ZNF139能夠通過誘導細胞周期抑制和促進凋亡來抑制細胞的增殖；通過transwell實驗發現轉染pcDNA3.1(+)-Flag-ZNF139質粒后實驗組細胞的遷移和侵襲能力明顯下調；因此進一步提示ZNF139作為功能性抑癌基因參與骨肉瘤的生物學進程。

p53在調控細胞周期和DNA損傷修復中起著關鍵作用，并且抑制正常細胞發展為惡性表型[18]。此外，腫瘤抑制蛋白p53是凋亡途徑的重要組成部分，BCL2和BAX都是p53的重要轉錄靶基因；BCL2和BAX能影響線粒體細胞膜凋亡方式[19]。在本研究中，ZNF139增加了p53的轉錄和p53下游靶基因如：p21、p27和BAX等的表達；進一步提示ZNF139通過激活p53信號通過參與骨肉瘤的發生發展。

綜上，本研究顯示ZNF139基因在骨肉瘤組織中表達下調，過表達ZNF139后能通過激活p53信號通路來調控骨肉瘤的進展。但ZNF139在組織和細胞系表達與臨床預后，以及體內實驗中是否作為抑癌基因參與腫瘤進展尚需要進一步的研究。