外源2,4-表油菜素內酯對NaCl脅迫下燕麥種子萌發和生理的影響

寇江濤

(1. 宜春學院生命科學與資源環境學院， 江西 宜春 336000； 2. 江西省作物生長發育調控重點實驗室， 江西 宜春 336000)

非生物脅迫是造成全球農業減產的主要因素，世界范圍內因非生物脅迫造成的農作物產量損失高達50%[1]。其中，鹽脅迫是影響作物生長和發育、限制產量形成的主要非生物脅迫因子之一，也是現代農業可持續發展所面臨的嚴峻問題[2]。鹽脅迫下，植物體內的水勢降低，鹽分離子增加，導致植物對水分的利用效率下降，細胞內穩態平衡遭到破壞，生長發育受到抑制[3]。研究[4]表明，鹽脅迫下，牧草種子的發芽率隨著鹽脅迫濃度的升高顯著降低，燕麥[5]種子的發芽率、發芽勢、苗高、根長和生物量均下降，萌發和生長受到抑制，且存在濃度效應。

油菜素內酯(Brassinosteroids，BRs)是Mitchell等[6]于1970年首次在油菜(BrassicanapusL.)花粉中發現、篩選和分離得到，被稱為第六大植物激素，對于植物的生長發育具有不可或缺的作用。研究[7-10]表明，正常條件或逆境脅迫下，適宜濃度的BRs處理，均可促進植物種子下胚軸的伸長，提高植物種子的發芽率。鹽脅迫下，適宜濃度的BRs能夠促進水稻(OryzasativaL.)[11]、小麥(TriticumaestivumL.)[12]、黃瓜(CucumissativusL.)[13-14]等作物種子的萌發和幼苗生長，提高其抗鹽性。

燕麥作為一種糧飼兼用作物，具有適口性好、易于栽培和貯藏等優點，已成為我國高寒牧區一年生高產、優質人工草地建植的優良飼草品種，也是我國半農半牧區的優質作物品種，在我國北方高寒牧區和農牧交錯區畜牧業穩定發展中發揮著舉足輕重的作用。因此，探尋減緩鹽脅迫對燕麥傷害的有效途徑，不管是對于燕麥種子萌發和植株生長，還是對其干草生產均具有重要意義。本研究以‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥為材料，研究不同濃度2,4-表油菜素內酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)對100 mmol·L-1NaCl脅迫下燕麥種子萌發的影響，旨在探討鹽脅迫下外源BRs對燕麥種子萌發的調控機制，為尋求減緩鹽脅迫對燕麥傷害的有效途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘加燕2號’(AvenasativaL.‘Jiayan 2’)和‘青引2號’(AvenasativaL.‘Qingyin 2’)燕麥。2,4-表油菜素內酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)為分析純(美國Sigma公司，Ruibio分裝)。

1.2 材料處理

選取飽滿、均勻、大小一致的供試燕麥種子，用0.1% HgCl2溶液消毒5 min，去離子水沖洗5～6次，吸水紙吸干后置于墊有2層定性濾紙的玻璃培養皿中，每皿100粒種子，將各處理培養皿置于種子發芽箱中進行發芽，發芽箱中的光通量密度為70 μmol·m-2·s-1，溫度為25℃± 1℃，相對濕度為80%左右。

1.3 試驗設計

預試驗發現，100 mmol·L-1NaCl脅迫對燕麥種子萌發及幼苗生長的抑制率均達到50%左右，對于燕麥而言適于中度鹽脅迫，因此本試驗選擇的NaCl脅迫濃度為100 mmol·L-1。本試驗設8個處理，分別為：對照(CK):蒸餾水，T0：100 mmol·L-1NaCl，T1：100 mmol·L-1NaCl + 10-5μmol·L-1EBR，T2：100 mmol·L-1NaCl + 10-4μmol·L-1EBR，T3：100 mmol·L-1NaCl + 10-3μmol·L-1EBR，T4：100 mmol·L-1NaCl +0.01 μmol·L-1EBR，T5：100 mmol·L-1NaCl +0.10 μmol·L-1EBR，T6：100 mmol·L-1NaCl+1 μmol·L-1EBR，每個處理6次重復。各處理培養皿中分別添加含相應濃度EBR的100 mmol·L-1NaCl溶液5 mL，CK添加 5 mL蒸餾水。為保證燕麥發芽過程中處理液濃度穩定，每24 h更換1次處理液。

1.4 指標測定

從燕麥種子發芽之日起，每天觀察并記錄發芽種子數，試驗結束后計算發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數，其中發芽勢和發芽率分別以4 d和10 d內正常發芽種子數進行計算。

試驗處理第4 d時，取樣測定燕麥種子的淀粉酶、蛋白水解酶活性及淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸含量，其中α-淀粉酶、β-淀粉酶活性和游離氨基酸含量參照鄒琦[15]的方法測定，蛋白水解酶活性參照張志剛等[16]的方法測定，淀粉和可溶性蛋白含量參照張志良[17]的方法測定。

試驗處理第10 d時，取樣測定燕麥幼苗的苗高、根長、幼苗干重和根系活力，其中根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[15]。

1.5 數據統計

采用Microsoft Excel 2003進行數據處理和圖表繪制，采用SPSS 16.0用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗，其中發芽勢、發芽率數據作反正弦轉換之后進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發和幼苗生長的影響

由圖1可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子的發芽勢、發芽率均顯著降低(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽勢分別降低70.42%和60.18%，發芽率分別降低44.19%和55.95%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的發芽勢和發芽率(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽勢分別提高214.29%和133.33%，發芽率分別提高50.00%和86.49%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽勢分別提高195.25%和141.67%，發芽率分別提高47.92%和91.89%。

圖1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子發芽勢和發芽率的影響Fig.1 Effects of EBR on the germination potential and germination rate of oat seed under NaCl stress注：圖中不同字母表示各處理之間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters mean significant difference at 0.05 level

由表1可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫顯著降低了燕麥種子的發芽指數、活力指數和根系活力(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽指數分別降低66.20%和68.21%，活力指數分別降低80.07%和82.20%，根系活力分別降低55.11%和53.42%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的發芽指數、活力指數和根系活力(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽指數分別提高178.13%和182.59%，活力指數分別提高333.75%和340.58%，根系活力分別提高54.93%和75.82%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發芽指數分別提高162.16%和183.19%，活力指數分別提高313.10%和339.21%，根系活力分別提高54.49%和77.75%。

由表2可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥幼苗的生長顯著受到抑制，苗高、根長和幼苗干重顯著降低(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別降低53.89%和68.24%，根長分別降低68.12%和65.28%，幼苗干重分別降低41.05%和44.03%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的苗高、根長和幼苗干重(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別提高52.67%和105.78%，根長分別提高83.64%和88.99%，幼苗干重分別提高55.95%和55.91%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別提高63.79%和99.39%，根長分別提高124.24%和84.59%，幼苗干重分別提高57.58%和55.09%。

表1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子發芽指數、活力指數和根系活力的影響Table 1 Effects of EBR on the germination index,vigor index and root vigor of oat seed under NaCl stress

注：同列數值后不同字母表示各處理之間差異顯著(P<0.05)，下表同

Note:Values followed by different letters in the same column indicate significant at 5% level,the same as following tables

2.2 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發過程中淀粉酶和蛋白水解酶活性的影響

由表3可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子萌發過程中淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)，蛋白水解酶活性顯著升高(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的α-淀粉酶活性分別降低43.54%和42.04%，β-淀粉酶活性分別降低38.31%和38.94%，蛋白水解酶活性分別提高67.09%和27.03%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR后，燕麥種子萌發過程中淀粉酶活性顯著提高(P<0.05)，蛋白水解酶活性顯著降低(P<0.05)。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的α-淀粉酶活性最高，分別提高61.20%和75.35%；T4和T5處理的β-淀粉酶活性最高，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的β-淀粉酶活性分別提高55.62%和68.72%，T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的β-淀粉酶活性分別提高53.91%和63.54%；T4和T5處理的蛋白水解酶活性最低，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的蛋白水解酶活性分別降低32.23%和17.19%，T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的蛋白水解酶活性分別降低30.91%和17.45%。

表3 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發過程中淀粉酶和蛋白水解酶活性的影響Table 3 Effects of EBR on the activity of amylase and proteolytic enzyme in the process of seeds germination under NaCl stress

2.3 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發過程中淀粉、可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響

由表4可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子萌發過程中可溶性蛋白含量顯著降低(P<0.05)，淀粉和游離氨基酸含量顯著升高(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量分別降低46.81%和47.86%，淀粉含量分別提高37.94%和36.98%，游離氨基酸含量分別提高67.06%和74.80%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR后，燕麥種子萌發過程中可溶性蛋白含量顯著提高(P<0.05)，淀粉和游離氨基酸含量顯著降低(P<0.05)，其中以T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量最高、淀粉和游離氨基酸含量最低。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量分別提高68.87%和61.92%，淀粉含量分別降低24.24%和22.74%，游離氨基酸含量分別降低30.79%和34.20%。

表4 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發過程中淀粉、可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響Table 4 Effects of EBR on the content of starch,soluble protein and free amino acid in the process of seeds germination under NaCl stress

3 討論

種子萌發是植物生命活動的開始，是植物生長發育的前提，也是植物產量形成的基礎。鹽脅迫作為限制植物種子萌發的主要非生態因子，其對植物所造成的直接傷害表現為種子萌發受到抑制，萌發時間延長，發芽率和發芽勢降低，導致幼苗和根系生長緩慢，生物量下降[18-22]。BRs雖然不是種子萌發的必要條件，但其可以通過生化機理調節和不同的信號途徑來調控植物種子的休眠和萌發[23]，能夠打破種子休眠，提高種子發芽率，促進細胞分裂和下胚軸的伸長，促進側根生長發育和植物幼苗生長，提高植物的抗逆性[7,24]，因此其與種子萌發和休眠的關系也成為逆境下種子生理生化研究的熱點。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的萌發顯著被抑制，添加外源EBR顯著緩解了NaCl脅迫對燕麥種子萌發的抑制作用，提高了‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數，并促進了燕麥幼苗和根系的生長，提高了根系活力和幼苗干重。說明外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子的萌發具有正向調控作用，而且存在顯著的濃度效應，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發抑制的緩解效果最佳，這與賈洪濤等[12]、吳雪霞等[9]、張紅[25]、Shu等[26]對鹽脅迫下外源BRs調控小麥、茄子(SolanummelongenaL.)、玉米(ZeamaysL.)和棉花(GossypiumhirsutumL.)種子萌發和幼苗生長的研究結果一致。

植物種子萌發的最初階段，其所需的營養物質和能量來源主要來自貯存物質的氧化分解，在淀粉酶和蛋白水解酶的催化作用下，種子中的淀粉和貯藏蛋白氧化分解釋放能量，并為胚的發育提供營養物質。研究[27]表明，鹽脅迫下植物種子萌發過程中的物質代謝發生紊亂，并產生滲透脅迫和離子毒害作用，過量的鹽分離子能夠降低淀粉酶和蛋白水解酶的活性，抑制淀粉和可溶性蛋白的水解，從而抑制種子的萌發；但低濃度的鹽脅迫對植物種子萌發具有促進作用，可能是由于低濃度的鹽分離子能夠提高淀粉酶活性，促進淀粉的水解[28]。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發過程中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性顯著降低，淀粉水解被抑制，蛋白水解酶活性顯著升高，可溶性蛋白大量水解，游離氨基酸含量顯著提高，說明NaCl脅迫下燕麥種子萌發其所需的營養物質和能量來源主要來自可溶性蛋白的水解，而淀粉的水解供能被抑制。

研究[29-31]表明，外源BRs可以調控植物種子萌發過程中α-淀粉酶的活性，促進淀粉水解供能，還可以調控植物細胞的伸長和分裂，促進植物種子下胚軸的伸長，在促進種子萌發的過程中和其他激素具有協同作用。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發過程中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，促進淀粉水解供能，并降低了蛋白水解酶活性，有效抑制可溶性蛋白水解和游離氨基酸的積累，說明外源EBR能夠通過調控NaCl脅迫下燕麥種子萌發過程中淀粉酶和蛋白水解酶的活性，來促進燕麥種子糊粉層中不溶性糖轉化為可直接利用的可溶性糖，并抑制可溶性蛋白的水解，從而促進燕麥種子的萌發，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發的促進效果最好。植物種子的萌發過程是一個復雜的生理生化過程，受到很多因素的影響，在植物種子的休眠和萌發過程中，多種激素都起到調控作用，而且不同激素之間也存在直接或間接作用，對植物種子的萌發具有促進作用或拮抗作用。因此，外源EBR促進NaCl脅迫下燕麥種子萌發的信號途徑和生化調節機理還有待進一步作深入的研究。

4 結論

100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發和幼苗生長顯著受到抑制，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性顯著降低，蛋白水解酶活性顯著提高，可溶性蛋白加速水解，游離氨基酸大量積累；添加外源EBR顯著提高了NaCl脅迫下‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數，促進了燕麥幼苗和根系的生長，提高了根系活力和幼苗干重，提高了燕麥種子萌發過程中的α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，降低了蛋白水解酶活性，有效抑制可溶性蛋白水解和游離氨基酸的積累。本試驗說明外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發的抑制作用具有明顯的緩解效應，且存在明顯的濃度效應，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR的處理效果最好。