日本結縷草衰老葉片全長cDNA文庫構建及酵母單雜交篩選驗證

滕 珂， 檀鵬輝， 范希峰， 岳躍森， 姜紅巖， 武菊英*

(1.北京市農林科學院，北京草業與環境研究發展中心， 北京 100097; 2. 北京林業大學，草業與草原學院， 北京 100083)

植物cDNA文庫是植物在特定發育時期或特定生長條件下轉錄的全部mRNA經過反轉錄而成的cDNA片段與文庫載體連接而成的克隆的集合[1]。自從1976年HOFSTETTER構建了首個cDNA文庫以來，cDNA文庫的應用越發廣泛，構建技術亦經歷了多次升級[2]。經典cDNA文庫受到克隆片段長度的限制，存在一定的天然缺陷[1]。全長cDNA文庫可提供完整的mRNA信息，并且可以用來研究mRNA可變性剪切信息[3]。均一化cDNA文庫，可增加獲取低豐度mRNA的概率[4]。構建cDNA文庫不僅可以保存瀕危物種的基因資源，也可以用于批量克隆基因而進行基因功能研究[3]。近年來，隨著分子生物學的不斷發展，對基因上下游調控機制的研究已越發受到青睞。因此，獲得一個高質量的cDNA文庫成為深入研究基因功能及其調控機制的重要基礎。

酵母單雜交系統是在酵母雙雜交基礎上衍生而來的，主要用來研究DNA與蛋白質的互作[5-6]。酵母單雜交的主要原理基于DNA結合域與轉錄激活域相互獨立，將獵物蛋白融合到含有GAL4轉錄激活域的載體中，然后用誘餌序列調取獵物蛋白激活下游報告基因，從而達到篩選或驗證的目的[7]。酵母單雜交系統的優點在于借助酵母體內表達，保證轉錄因子蛋白的自然結構，可更真實的模擬真核蛋白的表達模式[8]。目前，應用較為廣泛的酵母單雜交系統主要有pHIS2系統和pAbAi系統；前者不需要對表達載體進行線性化進而整合到酵母基因組，具有操作方便的優點,而后者采用金擔子素A(Aureobasidin A，AbA)作為篩選標記，具有靈敏度高的優點。但是，單純的酵母單雜交篩選無法完全避免假陽性的存在，需要結合雙熒光素酶(Dual-luciferase)分析和凝膠遷移(Electrophoretic mobility shift assays，EMSA)等手段進一步驗證互作的真實性。

日本結縷草(Zoysiajaponica)是一種重要的暖季型草坪草，因其耐踐踏、抗旱性強、耐鹽等優點而廣泛應用于運動場草坪的建植及城市綠化[9-11]。然而，較短的綠期成為制約結縷草在我國北方地區進一步推廣應用的重要因素[12-13]。因此，從分子水平上揭示日本結縷草葉綠素降解的調控機制顯得十分必要，可為延長綠期和延緩衰老提供理論依據。脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH)專一地催化脫鎂葉綠素a脫植醇生成脫鎂葉綠酸a，是調控葉綠素降解的一個關鍵酶[14]。但目前，有關PPH的上游調控機制仍不是十分清楚，在結縷草上更是如此。本研究旨在構建一個高質量的日本結縷草衰老葉片的全長cDNA文庫，并利用酵母單雜交技術篩選ZjPPH1基因的上游調控轉錄因子，以期為更好地探索日本結縷草的葉綠素降解和衰老途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用的植物材料為日本結縷草‘Meyer’品種，其幼苗放置于人工氣候箱(RXZ-380D-LED，寧波江南儀器)中培養。培養條件為28℃/25℃(晝/夜)，濕度65%，光照16 h·d-1，光強600 μmol·m-2·s-1，種植基質為草炭，蛭石和珍珠巖(2∶1∶1)混合基質，培養8個月。

RNA提取試劑盒購于OMEGA公司(美國)。cDNA構建試劑盒、亮氨酸缺陷型培養基(SD/-Leu)、色氨酸缺陷型培養基(SD/-Trp)、亮氨酸-色氨酸缺陷型培養基(SD/-Leu-Trp)、色氨酸-組氨酸缺陷型培養基(SD/-Trp-His)、亮氨酸-色氨酸-組氨酸缺陷型培養基(SD/-Leu-Trp-His)等這些酵母缺陷型培養基購自Clontech公司(美國)。感受態細胞HST08、限制性內切酶SfiI購于TaKaRa公司(日本)。酵母單雜交系統為BD公司(美國)(www.bdbiosciences.com)的pHIS2系統，3-AT (3-AMINO-1,2,4-TRIAZOLE)購自Sigma-Aldrich公司(德國)。所用的電轉儀為BIO-RAD公司(美國)的E.coli pulser。

1.2 方法

1.2.1總RNA的提取及全長cDNA的合成 選取健康生長的日本結縷草自然衰老的葉片，稱取0.1 g，液氮中全部研磨，用試劑盒提取總RNA，得到的RNA用DNase I處理。用Nano Drop 2000C分析提取的RNA的OD 260/280和OD 260/230的比值，之后經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測合格的RNA用于后續試驗。首先，取1 μg RNA使用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit合成第一鏈cDNA；然后利用Advantage HF 2 PCR Kit (Clontech公司)取2 μL第一鏈cDNA進行LD-PCR擴增，合成雙鏈cDNA。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA合成效果。

1.2.2cDNA短片段去除 使用限制性內切酶SfiI對cDNA進行酶切處理，然后使用CHROMA SPIN-1000-TE對酶切后cDNA進行過柱處理，去除短片段。經PCI/CI凈化處理后，用無水乙醇精制，最后用dd H2O 溶出。取1 μL cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測短片段去除效果。

1.2.3初級文庫質粒的獲得 使用DNA ligation Kit將pGADT7載體與適量過柱后的cDNA在12℃條件下過夜連接，將獲得的連接液進行純化精制，得到20 μL初級cDNA文庫。取0.5 μL初級文庫連接液，利用BIO-RAD公司的 E.coli pulser電轉儀轉化HST08感受態細胞(電轉條件為：1.8 KV，200 Ω，25 μF)。取10 μL轉化液涂布氨芐(Ampicillin，Amp)抗性的LB平板，37℃過夜培養，統計平板生長菌落的個數，按照文庫滴度(cfu·mL-1)=單菌落數量×稀釋倍數/涂板體積(mL)公式計算初級文庫的滴度。隨機挑取16個單菌落，使用通用引物pGADT7-F (5′-GGAGTACCCATACGACGTACC-3′)和pGADT7-R(5′-TATCTACGATTCATCTGCAGC-3′)進行插入片段檢測。

1.2.4初級cDNA文庫百萬級擴增及質粒提取 根據初級文庫的庫容大小，取初級文庫大于100萬克隆的量，計算需要的連接液的體積，電轉化至HST08感受態細胞中，涂布10個Amp抗性的LB大平板(24.5 cm×24.5 cm)，37℃過夜培養，監測實際轉化獲得的擴增克隆數量。回收擴增菌落，用Nucleo Bond Xtra Midi EF試劑盒(Clontech公司)進行質粒提取，取100 ng擴增文庫質粒進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5酵母單雜交篩選cDNA文庫 將前期試驗克隆得到的ZjPPH1基因啟動子的327 bp的序列通過同源重組的方法克隆到pHIS2載體中，獲得pHIS2-ZjPPH1pro重組載體。為確定能夠抑制HIS3表達背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-ZjPPH1pro質粒通過LiAc的方法[15]轉化Y187酵母感受態細胞，之后用0.9%的NaCl溶液將鑒定為陽性克隆的菌液OD值調到0. 2左右，然后取10 μL菌液稀釋1，10，100倍，分別點在含有0，50，60，80，100，150 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His平板上，30℃下培養48 h。監測酵母的生長情況，然后確定最低3-AT的濃度。

在確定好3-AT濃度之后，利用共轉化的方法進行酵母單雜交篩選。試驗設置正對照為：pGAD-Rec2-53+p53HIS2；負對照為：pGAD-Rec2-53+pHIS2。取10 μLcDNA文庫質粒(1 μg·μL-1)和5 μg pHIS2-ZjPPH1pro質粒，共轉化600 μL的Y187酵母感受態細胞。用0.9%的NaCl溶液將轉化后的Y187酵母感受態細胞稀釋到OD值約0.2。分別取100 μL 1/10、1/100和1/1000轉化后的酵母感受態細胞涂布于SD/-Leu，SD/-Trp和SD/-Leu-Trp的培養基上，以此監控轉化效率。剩下500 μL酵母感受態涂布于10個含有最適3-AT的SD/-Leu-Trp-His培養基平板上，30℃下培養48 h。挑取能夠正常生長的酵母單菌落，分別劃線至新的含有適量3-AT的SD/-Leu-Trp-His培養基上，能夠正常生長的即視為互作蛋白。最后，利用通用引物pGADT7-F和pGADT7-R進行菌落PCR，經測序后確定候選基因。

1.2.6候選基因的生物信息學分析 利用DNAMAN 8.0對PCR測序結果進行去載體片段處理，確定候選蛋白核苷酸序列。確定序列之后，制作FASTA格式文件，利用百邁客的云平臺小工具(https://console.biocloud.net)進行Nr(NCBI non-redundant protein database)，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)，Cog(Cluster of orthologous genes)，SwissProt (A manually annotated,non-redundant protein database)，Kog(euKaryotic orthologous groups)等注釋，獲得候選基因的生物信息學信息。

2 結果與分析

2.1 RNA提取及質量檢測

利用Nano Drop 2000C檢測RNA的質量和濃度，結果顯示OD260/280=2.07，OD260/230=2.13，RNA質量合格。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳再次檢測RNA的質量，結果顯示，18S和28S兩條帶清晰可見(圖1)，RNA質量可滿足建庫要求。

圖1 RNA質量檢測Fig.1 Quality verification of the RNA

2.2 全長cDNA合成

取5 μL cDNA進行1.5%瓊脂糖電泳檢測合成效果。結果顯示，獲得的cDNA長度分布在250～4 500 bp區間內(圖2)，表明已獲得質量合格的cDNA，可用于下一步試驗。

圖2 全長ds cDNA檢測Fig.2 Quality examination of the full length ds cDNA

2.3 短片段去除

用SfiI對上一步所獲得的cDNA進行酶切處理后，利用CHROMA SPIN-1000-TE進行過柱處理，去除短片段。經PCI/CI凈化處理后，取1 μLcDNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，小于500 bp的小cDNA片段和未使用完的引物、引物二聚體等得到有效去除，可用于下一步的連接轉化(圖3)。

圖3 短片段去除檢測Fig.3 Purifying of the ds cDNA

2.4 載體連接及初級文庫滴度檢測

經計算，該研究所獲cDNA初級文庫的庫容約2.0×106cfu·mL-1。隨機挑取16個單克隆，利用引物pGADT7-F和pGADT7-R進行菌落PCR檢測。電泳結果顯示，插入片段的長度分布范圍為500～3 000 bp，平均長度大于1 000 bp。16個克隆均可擴增出高亮條帶，重組率為100%(圖4)。

圖4 插入片段檢測Fig.4 Determination of the inserted cDNA segments注：1～16表示不同插入片段Note:1～16 representing different insert segments

2.5 初級cDNA文庫百萬級擴增及質粒提取

取初級文庫約130萬克隆的量電轉化HST08感受態細胞，涂布10個24.5 cm×24.5 cm的LB平板，37℃過夜培養檢測實際轉化獲得的擴增克隆數量。回收擴增菌落，使用NucleoBond Xtra Midi EF試劑盒進行質粒提取后，共獲得擴增文庫質粒約5 mg。取100 ng擴增文庫質粒進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，文庫質粒大小符合預期(圖5)。該研究獲得擴增文庫質粒充足，可滿足后續酵母單雜交等試驗需求。

2.6 pHIS2-ZjPPH1pro質粒最低3-AT濃度篩選

為確定能夠抑制HIS3表達背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-ZjPPH1pro質粒通過LiAc的方法轉化Y187酵母感受態細胞。用0.9%的NaCl水溶液將確定為陽性克隆的菌液OD調至0. 2左右，然后取10 μL梯度稀釋，分別點在含有0，50，60，80，100，150 mmol·L-13-AT的SD/-Trp-His的平板上。30℃培養48 h后的結果如圖6所示，在低濃度3-AT背景下，均發現有不同程度的酵母克隆生長；而在150 mmol·L-1的3-AT背景下，酵母生長明顯受到抑制，表明150 mmol·L-1的3-AT濃度可以有效抑制背景HIS3的表達，該濃度可用于下一步的酵母單雜交篩庫。

圖5 文庫質粒檢測Fig.5 Examination of the constructed cDNA library plasmid

2.7 酵母單雜交篩選候選基因

本研究采取共轉化的方法將10 μL文庫質粒(1 μg·μL-1)和5 μg pHIS2-ZjPPH1pro質粒共轉化600 μL準備好的Y187酵母感受態細胞。在含有150 mmol·L-13-AT的SD/-Leu-Trp-His平板上培養3 d后，檢測酵母的生長情況。結果發現，陽性對照幾乎長滿整個平板，而陰性對照未發現有菌落長出。觀察試驗組的情況，發現有零星的單菌落分布。挑取48個單菌落進行菌落PCR驗證，電泳結果顯示，42個菌落可擴增出條帶，其中有34個菌落可擴增出單一條帶。另外8個含有多個條帶，應該是轉入了多個質粒所致，為酵母單雜交過程中的正常現象。然后挑選20個條帶較亮的PCR產物送測序，分析候選基因。

圖6 酵母單雜交最適3-AT濃度篩選Fig.6 Screening of the optimal concentration of 3-ATused for yeast one-hybrid screening

圖7 酵母單雜交篩選Fig.7 Screening of yeast one-hybrid

2.8 候選基因的生物信息學分析

利用DNAMAN 8.0 去除PCR產物測序的載體序列片段后，利用百邁客云平臺的基因功能注釋功能對測序得到的20個候選基因序列進行注釋，結果表明，20個候選基因均可注釋到序列信息。Nr同源物種注釋結果表明，20個注釋到的基因中可比對到粟(Setariaitalica)的最多有7個，其次是玉米(Zeamays)和粳稻(OryzasativaJaponica Group)各3個。GO注釋結果表明，這些基因可分為細胞組分、分子功能和生化過程3大類。在細胞過程、單一組織進程和代謝過程所含的基因數量最多。KEGG注釋結果顯示，這些候選基因富集到了糖酵解、檸檬酸循環、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成、丙酮酸代謝路和丁酸甲酯代謝等通路。

圖8 候選克隆的PCR檢測Fig.8 PCR verification of the candidate clones注：1～48表示不同候選基因Note:1～48 representing different candidate genes

表1 候選基因的生物信息學分析Table 1 Bioinformatics analysis of candidate genes

NCBI登錄號NCBI accession number候選蛋白Candidate protein比對物種Aligned speciesGO注釋GO annotationMK283737假定蛋白Hypothetical protein 稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)—MK283738線粒體丙酮酸載體Mitochondrial pyruvate carrier 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)GO:0005743MK283739丙酮酸脫氫酶E1成分亞單位Beta 3 pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-3 短花藥野生稻(Oryza brachyantha)GO:0004739MK283741未知功能蛋白Uncharacterized protein 粟(Setaria italica)GO:0009941MK283742假定蛋白Hypothetical protein高粱(Sorghum bicolor)GO:0003677MK283743假定蛋白Hypothetical protein高粱(Sorghum bicolor)GO:0005840MK28374440S核糖體蛋白 40S ribosomal protein S14 粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0003735MK283740核定位序列結合蛋白Nuclear localization sequence-binding protein 粟(Setaria italica)GO:0000166MK283745重金屬相關的異戊基植物蛋白Heavy metal-associated isoprenylated plant protein 粟(Setaria italica)GO:0000302MK283746依賴于ATP的鋅金屬蛋白酶ATP-dependent zinc metalloprotease 粟(Setaria italica)GO:0004222MK283747未知功能蛋白Uncharacterized protein粟(Setaria italica)GO:0005739MK283748假定蛋白Hypothetical protein石藻(Emiliania huxleyi)GO:0043231MG870086未知功能蛋白Uncharacterized protein 玉米(Zea mays)—MK283749SPX含蛋白結構域SPX domain-containing protein 粟(Setaria italica)GO:0005634MK283750未知功能蛋白Uncharacterized protein 玉米(Zea mays)—MK283751假定蛋白Hypothetical protein 玉米(Zea mays)GO:0016023MK283752假定蛋白Hypothetical protein 油菜(Brassica napus)GO:0005840MH428376NAC蛋白NAC superfamily protein粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0003677MH479420AP2/ERF蛋白AP2/ERF superfamily protein粟(Setaria italica)GO:0009693MK286467SOC1蛋白SOC1 protein粳稻(Oryza sativa Japonica Group)GO:0004739

3 討論

構建高質量的cDNA文庫是利用酵母系統進行單雜、雙雜篩選互作蛋白的基礎。坪觀質量很大程度上決定了草坪草的市場價值，因此，衰老一直是草坪草研究的一個重要方向。本研究開展之前尚未發現有關構建日本結縷草衰老葉片cDNA文庫的報道，而該cDNA文庫的構建對揭示日本結縷草葉片衰老進程和葉綠素降解途徑的研究十分重要。衡量一個cDNA文庫的質量，滴度、重組率和插入片段的大小是主要的評價指標[16]。一般cDNA文庫的滴度要求不少于1.0×106cfu·mL-1 [17]。cDNA插入片段的大小以及重組率是另外兩個影響文庫質量的重要標準，植物cDNA長度一般大于或者等于1 kb，文庫平均插入片段過小會影響文庫質量，而過度篩除cDNA片段則會造成初始文庫的滴度過低，丟失部分基因信息[16]。本研究利用SMRT cDNA合成技術構建的cDNA文庫滴度約2.0×106cfu·mL-1，插入片段平均長度大于1 kb，cDNA片段插入重組率為100%，表明該文庫的完整性很高，可涵蓋絕大多數基因信息，并且達到了高質量的標準，可滿足后續酵母單雜交篩選的要求。

酵母單雜交技術是篩選與基因啟動子特異結合轉錄因子的有效手段，也可以用于鑒定與DNA互作的蛋白。Chen等[18]利用酵母單雜交技術研究了擬南芥PPH基因的上游調控轉錄因子，并證實SOC1轉錄因子可直接結合PPH的CArG-box來調控葉綠素降解。Wang等[19]利用酵母單雜交篩選，發現蘋果MYB22可結合UFGT和FLS基因啟動子的MYBCORE元件來影響黃酮醇的合成。Ma等[20]通過酵母單雜交揭示了番茄SlNAP2通過結合SlSAG113，SlSGR1和SlPAO的啟動子來調節葉片衰老。本研究利用pHIS2酵母單雜交系統，篩選到50余個可與日本結縷草ZjPPH1啟動子結合的候選菌落，為研究ZjPPH1的轉錄調控提供了基礎。

生物信息學分析表明，隨機挑選測序的20個候選基因都可以在Nr數據庫中獲得注釋。注釋到的20個候選基因比對到粟(Setariaitalica)的最多。盡管結縷草基因組已公布(http://zoysia.kazusa.or.jp./)，但此次分析結果顯示并未比對到結縷草相關基因，這可能是由于此版本的Nr數據庫不含結縷草的數據導致。根據已有研究報道并結合ZjPPH1啟動子序列作用元件分析，本試驗初步確定了NAC，AP2/ERF，SOC1，HGRP，CCH蛋白和40S核糖體合成蛋白作為后期試驗的候選基因。前期利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be)網站分析，在ZjPPH1的啟動子序列中發現CGT[G/A]，CArG作用元件，它們分別是NAC，AP2/ERF轉錄因子潛在的結合位點。此外，HGRP蛋白主要在維持細胞壁韌性和調節細胞生長中起作用[21]。CCH蛋白主要分布于衰老葉片的維管束和葉柄中，可調控銅元素在衰老組織和繁殖器官之間的轉運[22]。40S核糖體合成蛋白在細胞增殖中可起到非常重要的作用，其功能的缺失可嚴重影響細胞的生長周期[23]。這些蛋白在日本結縷草葉片衰老和葉綠素降解中的作用和結合的作用元件仍不清楚，需要進一步的雙熒光素酶系統和EMSA等試驗的驗證。GO注釋結果顯示，這些候選基因可能主要參與了細胞過程、單一組織進程和代謝等生物過程。KEGG注釋結果表明，這些候選基因在糖酵解、檸檬酸循環、纈氨酸等通路中起調控作用。這些生物信息學分析結果為進一步挖掘候選基因提供了參考。

4 結論

本研究率先利用SMRT cDNA合成技術構建了日本結縷草衰老葉片的cDNA文庫，其滴度為2.0×106cfu·mL-1，插入片段平均長度大于1 kb，cDNA片段插入重組率為100%。該文庫的完整性較高，可涵蓋絕大多數基因信息，為酵母單雜交篩選奠定了基礎。

利用酵母單雜交技術，篩選到可與ZjPPH1基因啟動子結合的候選基因42個，并對20個候選基因進行測序和生物信息學分析，初步篩選到6個參與細胞生長和衰老過程的重要候選基因。為進一步探索ZjPPH1基因在日本結縷草衰老和葉綠素降解中的上游調控機制提供了理論支撐。