煙草病毒病檢測方法的研究現狀

摘 ?要：目前針對煙草花葉病毒病、煙草黃瓜花葉病毒病、馬鈴薯Y病毒病的檢測方法主要有指示植物法、電鏡診斷法、血清學檢測法、核酸分子雜交技術、以PCR為基礎的分子生物學技術等，通過闡述這些檢測方法的原理，分析其優勢及不足，為煙草病毒病檢測技術的發展提供科學依據及理論參考。

關鍵詞：煙草病毒病;檢測方法;研究現狀

中圖分類號：S435 ? ? ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ? ? 文章編號：2095-2945（2019）35-0140-02

Abstract： At present，the detection methods of tobacco mosaic virus（TMV）， cucumber mosaic virus（CMV） and potato virus Y （PVY） are mainly about plant method， electronmicroscopy， serological detection， nucleic acid molecular hybridization， molecularbiology technology based on PCR， etc. By expounding the principles of these detection methods and analyzing their advantages and disadvantages， this paper provides scientific basis and theoretical reference for the development of tobacco virus disease detection technology.

Keywords： tobacco virus; detection methods; research status

煙草病毒病種類多、分布廣，是我國煙區的重要病害之一。二十世紀五十年代以后，煙草病毒病先后在世界各地發生危害并暴發性流行，給煙草生產造成了重大損失。目前，世界煙草病毒種類達47種，常見的有20余種，我國在煙草上已發現的病毒有17種，其中危害較嚴重，發生較普遍的主要是煙草花葉病毒（TMV）、煙草黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）等3種病毒。針對這三種病毒的檢測方法主要有指示植物法、電鏡診斷法、血清學檢測法、核酸分子雜交技術、以PCR為基礎的分子生物學技術等。

1 指示植物法

該方法是將對某種病毒有專化性反應的植物作為指示植物，根據病毒侵染指示植物后表現的癥狀，鑒別病毒的存在與否及種類。作為指示植物其最大的特點就是對某一種或幾種病毒特別敏感，并且呈現明顯的外表癥狀，例如在洋酸漿上接種PVY葉片出現小枯斑。在病毒含量較少的情況下，被侵染的植物本身癥狀表現不出來或在體內表現為潛伏狀態時，在指示植物上可表現出明顯的外部癥狀。這種鑒定病毒的方法操作簡單、準確度高，但檢測速度慢、費用高，特異性差，存在一病多癥、多病一癥的現象。

2 電子顯微技術

自1940年Kausche和Melcher首次在電鏡下觀察到TMV以來，電鏡已成為植物病毒研究的常規手段之一。常見的電子顯微技術有負染色法、超薄切片和免疫電鏡等，這些技術可以直觀地反映病毒粒子的形態結構、在寄生細胞內的存在狀態、病毒的復制和裝配、以及寄主細胞的結構變化等過程。Edwardson等總結了各種植物病毒的形態學和細胞病理學特征，認為一般情況下運用負染色法和超薄切片電鏡觀察就能夠診斷和鑒別出植物病毒，通常可診斷到組水平，根據有些細胞的病變特征還能鑒別到病毒的種甚至株系。電子顯微鏡技術可以直接觀察到病毒的存在與否和形態結構，可以說是最直接，最準確的檢測病毒的手段。

3 血清學檢測方法

血清反應又叫免疫反應，是指抗體與抗原的特異性結合使抗原失去活力的反應。利用血清反應可以檢測病毒的存在與否。常用的血清學檢測方法有酶聯免疫吸附法、點免疫結合測定技術和電化學酶聯免疫檢測技術等。

3.1 酶聯免疫吸附法（ELISA）

目前，ELISA是植物病毒檢測過程中最常用的方法之一。該方法的原理是將抗原或抗體吸附在固體支持相上，用酶標記抗原或抗體，定性或定量的檢測相應的抗體或抗原。Voller和Clark等于1976年首次將ELISA引入植物病毒檢測，目前已形成多種檢測方法，常用的方法有6種：直接法、間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法及雙抗體夾心法等，其中應用最廣的是間接法和雙抗體夾心法。常用的抗體是多克隆抗體和單克隆抗體，多克隆抗體制備簡單，應用廣泛，而單克隆抗體制備過程較復雜，但專化性強，在低濃度病毒的鑒定和病毒株系的鑒定方面有突出優勢。ELISA克服了常規血清學方法在病毒檢測過程中的局限性，具有特異性強，靈敏度高，穩定簡便等優點。

3.2 點免疫結合測定技術（DIBA）

DIBA又叫組織印跡法，是在ELISA的基礎上發展起來的植物病毒檢測技術。該方法用硝酸纖維素膜（NCM）替代酶聯板，在簡化操作程序的同時，保持了靈敏度高，特異性強的特點，病毒檢測過程更快速、簡便。DIBA可采用直接或間接ELISA進行植物病毒檢測，通常間接ELISA的靈敏度比直接ELISA高。

3.3 電化學酶聯免疫檢測（ECEIA）

ECEIA是將電化學分析法與酶免疫分析法相結合的一種新的檢測方法，該方法結合了電化學分析法的高靈敏度和酶免疫分析法的高特異性，它是以酶標抗原催化電活性產物的產生為基礎的檢測方法。電化學反應發生在電極或液體的表面，該反應檢測分析的信號只與被檢測物表面的濃度相關，因此該方法適用于檢測少量樣品。ECEIA主要包括安培酶聯免疫分析法和伏安酶聯免疫分析法2種技術，用于植物病毒檢測的主要是伏安酶聯免疫分析法。ECEIA靈敏度高、準確性好、操作簡單，目前已成功研制出多種病毒的檢測試劑盒。

4 核酸分子雜交技術

雜交是指核苷酸序列通過堿基互補配對形成穩定的雜合雙鏈的過程。雜交雙方分別是使用的探針和待檢測的核酸。常見的核酸雜交技術包括：

（1）Southern雜交。DNA片段電泳后從瓊脂糖凝膠中轉印到NCM或尼龍膜上，然后進行探針雜交，被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。

（2）Northern雜交。該方法與Southern雜交很相似，RNA片段電泳后，將RNA轉印到NCM上，然后與探針雜交，主要區別在于Northern雜交的被檢測對象是RNA。為了除去RNA中的二級結構，保證RNA按分子大小進行分離，一般用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性。

（3）點雜交。點雜交是雜交信號呈現斑點樣的雜交方法，將DNA或RNA樣品直接點在NCM或尼龍膜上與探針分子雜交。對于DNA或RNA，該方法操作簡單結果直觀，適用于大批樣品的檢測。

5 分子生物學技術

聚合酶鏈式反應（PCR）被廣泛地應用于生物學、遺傳學及遺傳工程等領域。PCR技術在植物病毒的檢測領域方面具有特異性強、靈敏度高、高效準確等優勢。基于PCR技術又衍生出一些新的檢測技術，為植物病毒的檢測提供了便捷。

（1）RT-PCR。反轉錄PCR（RT-PCR）是一種常用的植物病毒檢測技術。該方法是以待檢測的病毒RNA為模板進行反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板在PCR儀上進行擴增，一種病毒的不同株系可以利用不同引物來區分。RT-PCR檢測技術超越了血清學方法，為病毒檢測提供了更專一、準確的手段，在病毒檢測方面應用廣泛。

（2）實時熒光RT-PCR。實時熒光RT-PCR是將RT-PCR與熒光技術相結合的檢測手段，利用熒光染料或熒光標記的探針與PCR擴增產物相結合，在擴增的每一次循環中都可以觀察到熒光強度的變化，這種變化反映擴增產物量的增減，最終通過繪制標準曲線得到反應初期的靶基因數量。與常規RT-PCR相比，實時熒光RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、測定偏差小等特點。

（3）免疫捕捉PCR技術（IC-RT-PCR）。免疫捕捉PCR技術是指在進行RT-PCR擴增反應之前，利用抗原抗體特異性結合的原理將待測病毒固定在微管或微板上，通過洗滌、洗脫處理富集病毒，之后再進行RT-PCR反應。該方法不僅避免了常規RT-PCR檢測過程中對核酸樣品制備的損失和破壞，而且提高了反應的靈敏度。Wetzel等首次利用IC-RT-PCR技術檢測李痘病毒。

6 等溫環介導技術（LAMP）

LAMP是日本學者Notomi等于2000年研發的一種新的核酸擴增技術。該技術針對目的基因的6個區域設計出4條特異性引物進行擴增，在恒溫條件下依賴鏈置換反應在DNA聚合酶的催化下進行擴增，無需像PCR一樣經過變性、退火和延伸三個過程。檢測LAMP產物的方法有多種，對產物進行電泳可觀察到梯狀條帶，在產物中加入熒光染料，在紫外燈下會發出綠色熒光。在LAMP擴增過程中，dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg+結合會產生焦磷酸鎂鹽白色沉淀，可通過肉眼觀察到。該技術具有的靈敏度高、特異性強、成本低等特點。

以上六種方法是目前針對煙草病毒病的檢測方法，但仍存在一些弊端。血清學檢測方法特異性差，容易受外界因素影響，檢測過程花費時間長，并且抗體價格較高;傳統的分子生物學方法需要提取植物總RNA，在提取過程中RNA易降解，且提取時間長，成本高;等溫環介導技術容易產生假陽性，產物易污染。

目前，就如何高效、快速、低成本地檢測煙草病毒，許多研究員探索了一些快速檢測煙草病毒的方法體系，劉勇等利用組織印跡法檢測到了煙草TMV和CMV，該方法操作簡便，但只適用于檢測新鮮樣品，對于冷凍保存的樣品檢測結果容易受印跡后留下的褐色斑干擾;于翠等利用IC-RT-PCR檢測到了CMV，該方法省去了提取核酸的步驟，但抗體包被、洗脫處理等步驟所需時間較長;代園鳳等利用煙草葉片的浸提液，以PVDF膜為吸附膜，結合RT-PCR檢測到了煙草PVY，該方法雖然省去抽提核酸的步驟，加快了檢測速度，但體系不太穩定，仍需進一步優化。關于煙草病毒病的檢測方法是一個長期、持續性的研究方向，需要不斷的嘗試、探索，為更快、更準確、成本更低、適用性更廣的檢測技術奠定基礎。

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