水質中大腸桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

樓秋雯 陳為為 黃志廣 安紫琿 朱振洪

摘 ?要：[目的]建立迅速、特異的水質中大腸桿菌群熒光定量PCR檢測方法。[方法]根據Genbank中大腸桿菌保守的uida基因序列，設計特異性引物，擴增并構建重組質粒作為標準品。同時設計熒光定量PCR引物，優化熒光定量PCR定量反應體系，建立水質中大腸桿菌的絕對定量方法。[結果]成功地構建了含uida基因的重組質粒，利用標準質粒為參照，分別對不同來源的水質進行檢測，成功檢出每微升水質中大腸桿菌的基因拷貝數，且方法具有特異性好、重復性高的特點。[結論]初步建立水質中大腸桿菌的熒光定量PCR檢測方法，可為飲用水中大腸桿菌迅速檢測，包括污染源頭診斷的標準方法的確立提供依據。

關鍵詞：水質;大腸桿菌;熒光定量PCR;檢測方法

中圖分類號：TV697.3 ? ? ? 文獻標志碼：A ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2019）35-0118-04

Abstract： Objective： To establish a rapid and specific fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in water quality. Methods： According to the conserved uida gene sequence of Escherichia coli in Genbank， specific primers were designed to amplify and construct the recombinant plasmid as the standard. At the same time， the fluorescence quantitative PCR primers were designed， the fluorescence quantitative PCR quantitative reaction system was optimized， and the absolute quantitative method of Escherichia coli in water quality was established. Results： The recombinant plasmid containing uida gene was successfully constructed. Using the standard plasmid as a reference， the water quality from different sources was detected， and the gene copy number of Escherichia coli in each microliter of water quality was successfully detected. And the method has the characteristics of good specificity and high repeatability. Conclusion： The preliminary establishment of a fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in drinking water can provide a basis for the rapid detection of Escherichia coli in drinking water， including the establishment of a standard method for the diagnosis of pollution sources.

Keywords： water quality; Escherichia coli; fluorescence quantitative PCR; method

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱大腸桿菌，在一定條件下可以引起人和多種動物發生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染，是人體內較為常見的食源性致病菌。近年來，因大腸桿菌污染水或食物造成人類食物中毒的例子日益增多，該污染物給飲用水水質帶來了極大的安全隱患[1]。中華人民共和國國家標準《生活飲用水水質衛生規范》規定，總大腸菌群及糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出。因此，實現水質大腸桿菌的快速檢測顯得尤為重要。

目前，檢測大腸桿菌的技術有很多，如多管發酵技術、膜過濾技術、酶聯免疫分析法[2]、基因芯片技術、高效液相色譜法等，其中基因芯片技術和色譜測定能夠靈敏、迅速、準確的檢測，然而局限性太大且費用昂貴。隨著分子生物學技術的發展，熒光定量PCR檢測方法以其快速和可批量檢測等優點[3]，成為了基因檢測的常用方法。基于目前廣泛研究的基礎，熒光定量PCR在大腸桿菌的快速大規模篩查中具有明顯的應用優勢。本研究以大腸桿菌菌群相對保守的uida基因[4]為檢測靶基因，設計熒光定量PCR引物，建立實時熒光定量PCR反應體系，來檢測不同水域中單位體積大腸桿菌中uida基因拷貝數，并評價熒光定量PCR方法較在水質檢測中的靈敏度、特異性、重復性，為后續水質大腸桿菌的高效、便捷的檢測應用打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌E. coli BL21、E. coli TG1均由本實驗室保存并提供。

1.1.2 試劑

pTA2載體購自上海捷瑞生物公司，基因組提取試劑盒、割膠回收試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒等均為上海莊盟生物科技有限公司的產品。NaCl為無錫市東昌化學試劑有限公司產品，瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物等化學試劑均購于上海澤衡生物技術有限公司。10×PCR buffer，MgSO4（50mmol/L），dNTPS（2.0mmol/L），Taq酶，50% DMSO，2×SYBR premix Ex-Taq等均購于TOYOBO公司。uida基因片段相關引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

1.1.3 儀器

臺式高速冷凍離心機（德國西格瑪有限公司，Sigma 3K-15）;水平電泳系統（北京市六一儀器廠，DYCP-31D）;恒溫培養箱（太倉精宏儀器設備有限公司，JINGHONG）;恒溫搖床（上海博迅實業有限公司，DSHZ-300A）;電泳成像系統（上海天能科技有限公司，Tanon-2500）;超凈臺（蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-IF）;水浴鍋（太倉精宏儀器有限公司，JINGHONG）;熒光定量PCR儀（德國耶拿分析儀器股份公司，MiniOpticon）;紫外-可見分光光度計（上海滬粵明科學儀器有限公司，TU-1900）;圖像分析系統（Tanon，Image master VDS）。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌E.coli BL21菌基因組提取

BL21菌液培養至測到菌液吸光值為OD=0.2-0.6時，根據上海莊盟生物科技有限公司基因組提取試劑盒說明書對BL21菌進行總DNA的提取。質粒DNA提取方法參考小量質粒抽提試劑盒內說明書。提取后的質粒DNA用紫外分光光度計測定其OD260/OD280的數值。

1.2.2 PCR擴增大腸桿菌uida保守基因片段

通過GenBank查找uida基因序列，通過BLAST比對篩選出更為保守的基因片段約為800bp，設計兩對PCR引物（如表1所示），采用表1中的uida-F/uida-R引物，以大腸桿菌基因組為模板，對大腸桿菌uida保守基因片段進行常規PCR反應。反應體系共計50L，ddH2O 37.5L，基因組模板1L，10×PCR buffer 5L，2mM dNTP 4L，Taq酶（5U/L） 0.5L，上下游引物各1L。擴增反應程序如下：94℃預變性3min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，30個循環進行延伸;4℃保溫10min。反應結束后，取5LPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，再由割膠回收試劑盒割膠回收，-20℃保存。

1.2.3 標準品重組質粒構建

將上述克隆的uida基因片段通過TA克隆方法與pTA2載體連接[5]，反應體系如下：目的基因7L，pTA2載體1L，T4連接酶1L，T4連接酶buffer 1L。16℃水浴連接16h后，將uida重組質粒轉化至TG1菌感受態細胞[6]中，均勻涂布到含氨芐的LB平板中，37℃培養12-16h。挑取單菌落培養過液后進行測序。抽提質粒進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所獲得的重組質粒命名為pTA2-uida。

1.2.4 熒光定量PCR條件優化

熒光定量PCR引物采用表1中的quida-F1/quida-R1的引物，通過優化熒光定量PCR反應體中退火溫度，退火溫度選擇在55～65℃范圍內，以1℃作為梯度進行優化。最佳條件根據擴增曲線的Ct值和熔解曲線來判斷。

1.2.5 標準曲線的建立

紫外分光光度計檢測得質粒濃度為123ng/L，根據公式DNA（copies/L）=6.02×1023×DNA總量/（660×DNA長度）[7]得本次標準質粒的濃度為3×1010copies/L。用超純水稀釋30倍后再以10倍等濃度稀釋，選取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7copies/L標準品質粒，利用優化的熒光定量PCR反應條件，同時設置陰性對照孔（以無菌水為模板）進行檢測，繪制擴增曲線與熔解曲線。最后，以X軸為Ct值，Y軸為拷貝數的對數建立標準曲線。

1.2.6 靈敏度試驗

以uida基因克隆轉化得到的質粒DNA為模板，進行系列梯度稀釋，選取5個梯度，各取3L稀釋度模板來進行熒光定量PCR，確定檢出下限。

1.2.7 重復性試驗

3次重復性測定107copies/L、105copies/L、103copies/L高中低三個梯度質粒模板Ct值，分析梯度內的Ct值和變異系數，以此評價方法的精確度[8]。

2 結果與分析

2.1 常規PCR擴增uida保守基因電泳圖鑒定

大腸桿菌uida保守基因擴增產物大小為759bp，電泳圖顯示目的條帶與預期的大小一致（如圖1所示）。

2.2 熒光定量PCR優化體系構建

系列梯度優化后的熒光定量PCR的反應體系（20L）如下，ddH2O7L，引物10.5L，引物20.5L，2×SYBR mix 10L，水樣模板1L。熒光定量PCR反應程序：95℃ 2min，然后95℃ 11s，61℃ 30s，72℃ 20s，共40個循環。

2.3 標準曲線的建立

2.3.1 擴增曲線與標準曲線

選取5個梯度（103～107copies/L）的標準重組質粒，進行熒光定量PCR檢測，如圖2所示，曲線呈現S型，表明Ct值與濃度存在良好的線性關系。由此，以模板濃度對數值為縱坐標，Ct值為橫坐標建立熒光定量PCR檢測E.coli的標準曲線（如圖3所示）。曲線回歸的標準方程為：Y=-0.3823X+12.172（直線斜率A=-0.3823，截距B=12.172，X=模板濃度，單位為copies/L），且曲線的相關系數R2>0.98，說明可信度較高。

2.3.2 熔解曲線

選取5個濃度的標準重組質粒熒光定量PCR檢測后進一步進行熔解度曲線分析，不同濃度標準品的熔解溫度均為83℃，呈單一峰，說明擴增條帶特異性較高。

2.4 靈敏度試驗

分析擴增曲線（如圖3）可知，模板濃度低至103copies/L時，仍可觀察到擴增曲線。熒光定量PCR最低可檢出每微升中，103copies/L的大腸桿菌DNA。此方法的靈敏度滿足對不同水樣的檢測要求。

2.5 重復性試驗

重復性測定107copies/L、105copies/L、103copies/L高中低三個梯度質粒模板Ct值，計算平均值和變異系數（如表2所示）。可知，隨濃度降低，擴增曲線的標準差逐漸增大，變異系數則始終小于1%，則說明在合理的誤差范圍內，建立的水質熒光定量PCR方法重復性好。

2.6 水質檢測結果

以建立的熒光定量PCR方法檢測水質中大腸桿菌群，將測得的Ct值帶代入標準曲線，計算不同來源水質的拷貝數。結果表明，渾濁陰溝的大腸桿菌含量最高，自來水中大腸桿菌含量相對較少。

3 討論

大腸桿菌作為糞源性污染衛生細菌學指標，在環境水質監測中起著非常重要的指示作用。若水體中檢測出大腸桿菌則意味著水質已被污染[9]。分布在自然界的大腸桿菌大多數是不致病的，主要附生在人或動物的腸道里，為正常菌群，但少數的大腸桿菌具有毒性，侵入人體時，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等[10]。對老人及小孩的感染可能是致命性的。因此，我國在飲用水方面的衛生標準限定100ml水樣中不得檢測出大腸桿菌，該標準要求必須達到檢出單個細菌的水平。

目前，大腸桿菌群的固有檢測方法有多管發酵技術、膜過濾技術、酶聯免疫分析法等。傳統的多管發酵法費時費力;膜過濾技術檢測出來的誤差較大;酶聯免疫分析法則不具備廣泛性。因此，尋求建立快速、敏感的水質大腸菌群檢測方法迫在眉睫。

本研究以uida為靶基因，設計特異性引物，優化熒光定量PCR定量反應條件，建立了大腸桿菌群的熒光定量檢測體系，此方法具有敏銳、迅速、特異、重復性好等優點，對不同水樣的測試結果也表明此法具有較高的檢測能力和效率，大大減少了時間和人工成本，檢測靈敏高且精準，在飲用水工業中具有廣泛的應用前景。下一步將對熒光定量PCR定量檢測和傳統檢測方法進行比較研究，對兩者相關性進行探索，為水質的快速檢測提供依據。

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